一、组织蛋白酶B酶联免疫吸附测定方法的建立（论文文献综述）
胡南均[1]（2021）在《氧化应激感受蛋白Pirin在癌细胞铁死亡中的作用及分子机制研究》文中进行了进一步梳理铁死亡是近年来新发现的一种细胞死亡形式,是由于铁依赖性的脂类过氧化物聚集导致的细胞死亡。主要特征表现为细胞皱缩、线粒体膜密度增高,同时不具有典型细胞凋亡和细胞坏死特征。在癌症的发生发展中,癌细胞的特征之一即是有效逃避细胞的程序化死亡机制,这也成为癌症治疗耐药性的原因之一。与正常细胞相比,肿瘤细胞增殖的过程中需要大量的铁参与,这种铁依赖性导致了癌细胞对铁死亡这一方式的敏感性增高。因此,诱导癌细胞铁死亡成为了癌症治疗的重要方向之一。研究发现铁死亡诱导剂可有效调节癌细胞铁死亡的发生,而不同类型的癌细胞对铁死亡的敏感度亦存在差异。在临床应用中,有证据表明铁死亡靶向治疗在RAS突变的癌症中具有良好的临床效果。因此,理解铁死亡在癌细胞中的作用机制及通过具体信号通路干预癌细胞铁死亡可为铁死亡靶向治疗领域带来巨大贡献。目前已知的铁死亡诱导剂多是通过靶向人体抗氧化系统,特别是SLC7A11-GPX4作用轴。虽然铁死亡具有细胞特异性,但细胞内铁堆积和脂质过氧化依旧是铁死亡的两个重要细胞致死途径。在多个细胞死亡途径中,细胞器可具有特异性的细胞功能。譬如在铁死亡中发现了线粒体、内质网和溶酶体具有代谢重塑功能,并在蛋白质正确折叠、自噬降解等方面起到重要的作用。其他细胞器如:高尔基体、过氧化物酶体等也可通过氧化修饰、脂类合成等方面调节细胞铁死亡的敏感性。虽然细胞器相互作用的复杂网络决定了铁死亡的进程,但具体的分子机制尚未完全明确。Pirin是一个位于细胞核中具有转录调节作用的铁依赖氧化应激感受蛋白。在人体正常组织中Pirin的表达水平相对较低,然而却在多种上皮源性的癌症中高表达。由于Pirin与细胞中的氧化应激反应有关,因此我们推测Pirin在脂质过氧化相关的细胞铁死亡这一模式中可能具有重要作用。同时,基于以往关于细胞铁死亡途径与自噬相关的研究事实,我们认为Pirin参与的细胞铁死亡调节可能与激活自噬相关机制相关。本研究中,我们对细胞核铁结合蛋白Pirin在铁死亡中的作用进行了分析,证实了Pirin在铁死亡中作为氧化应激感受调节蛋白使癌细胞具有铁死亡靶向治疗抗性。我们发现,Pirin在铁死亡诱导剂作用下在多个癌细胞中表达上调,且与细胞脂质过氧化过程高度相关。Pirin的上游作用分子NFE2L2/NRF2可直接调节Pirin表达,而下游可限制长链酰基辅酶A合成酶4依赖的铁死亡。当实验中将Pirin基因敲除时,细胞对铁死亡诱导剂更加敏感并导致DNA损伤,同时导致DNA分子伴侣HMGB1的细胞质移位及胞外释放促进的自噬发生。最后在小鼠皮下移植瘤实验中,我们确认了阻断Pirin通路可以强化铁死亡诱导剂产生是肿瘤抑制效果。这项研究拓展了诱导肿瘤细胞铁死亡的分子作用网络并为癌症的治疗提供了新的靶点。方法:体外实验选取四种不同癌症细胞系（PANC1、MIAPa Ca2、Hep G2、A549）并主要在胰腺癌细胞系PANC1中进行机制研究。（1）为了观察Pirin在胰腺癌细胞铁死亡中的表达及其表达调节与脂质过氧化的关系,应用铁死亡诱导剂Erastin（10μM）或RSL3（0.5μM）分别对PANC1和MIAPa Ca2细胞处理12小时。通过与铁死亡诱导剂Erastin（10μM）或RSL3（0.5μM）共同与抗脂质氧化作用的Lip-1（200n M）和NAC（1m M）处理细胞12小时,观察细胞铁死亡中脂质过氧化与Pirin表达的关系。Pirin的m RNA表达应用实时定量聚合酶链式反应确定。通过多不饱和丁间二烯基氧化后荧光峰值由590nm移位至510nm计算各条件下脂质过氧化物的产生量。（2）为了研究NFE2L2与Pirin在细胞铁死亡中的调节关系,应用Erastin（10μM）或RSL3（0.5μM）与NFE2L2抑制剂ML3855（5μM或10μM）共同处理12小时。通过实时定量聚合酶链式反应的方法确认Pirin的m RNA表达水平。应用sh RNA技术敲除细胞内NFE2L2后,经Western Blot法检测各组中Pirin、NFE2L2的蛋白表达。（3）为了研究Pirin的表达对细胞铁死亡的影响,首先通过Western Blot法检测sh RNA技术敲除细胞内Pirin的效率。通过细胞活性检测法确认以下各组药物处理12小时后细胞的死亡率,并同时检测脂类过氧化物的产生量:阴性对照、Erastin 10μM、Erastin 10μM+liproxstatin-1 200 n M、Erastin 10μM+triacsin C 10μM、Erastin 10μM+Z-VAD-FMK 10μM、RSL3 0.5μM、RSL3 0.5μM+liproxstatin-1 200 n M、RSL3 0.5μM+triacsin C 10μM、RSL3 0.5μM+ZVAD-FMK 10μM。（4）为了研究Pirin的表达对铁死亡中重要因素:长链酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）的影响,应用实时定量聚合酶链式反应的方法确认sh RNA对照组和Pirin sh RNA敲除组中细胞经Erastin（10μM）或RSL3（0.5μM）处理12小时后ACSL4的m RNA表达变化,应用酶联免疫吸附法测定ACSL4代谢产物花生四烯酸的变化。（5）为了研究Pirin的表达对铁死亡中DNA损伤的影响,应用酶联免疫吸附法测量sh RNA对照组和Pirin sh RNA敲除组细胞经Erastin（10μM）或RSL3（0.5μM）处理后DNA损伤标记物γ-H2AX和氧化DNA损伤标记物8-oxo-7,8-dihydro-20-deoxyguanosine（8-oxod G）的变化。（6）为了研究Pirin在铁死亡中的调节与诱导自噬及氧化应激相关蛋白HMGB1的关系,经sh RNA敲除Pirin后应用Western Blot法检测细胞质中HMGB1蛋白的表达确定细胞质移位、免疫共沉淀后HMGB1与BECN1的结合、以及自噬小体标记蛋白MAP1LC3B-I和-II的表达。同时应用酶联免疫吸附法测定细胞培养基中释放的HMGB1水平的变化。通过细胞活性检测法确认HMGB1抑制剂甘草甜素对细胞死亡率的影响。体内实验选取无胸腺的免疫缺陷小鼠,进行皮下种植瘤实验。为了研究Pirin的表达对细胞铁死亡的影响,通过sh RNA对胰腺癌细胞中Pirin进行敲除后种植于小鼠皮下。应用腹腔注射Erastin衍生物imidazole ketone erastin（40 mg/kg）诱导铁死亡后,首先对Pirin sh RNA组和对照组的种植瘤体积进行测量。然后应用实时定量聚合酶链式反应测定瘤组织内ACSL4的m RNA表达水平来研究Pirin与ACSL4表达的关系,再通过酶联免疫吸附法测定瘤内终末脂质过氧化物丙二醛的变化。为了确定体内实验中诱导肿瘤死亡方式为铁死亡,通过酶联免疫吸附法测定瘤内凋亡蛋白酶caspase-3的水平。最后通过酶联免疫吸附法分析小鼠血浆中游离HMGB1水平确认Pirin表达与自噬的相关性。结果:1.细胞诱导铁死亡中NFE2L2对Pirin表达进行调节。2.Pirin限制ACSL4依赖的细胞铁死亡。3.Pirin通过抑制HMGB1自噬通路对铁死亡进行抑制。4.体内实验表明Pirin限制铁死亡介导的肿瘤抑制。结论:本研究中我们发现了Pirin通过抑制DNA损伤调节的自噬通路对细胞铁死亡产生影响。针对铁死亡的Pirin信号通路的干预在体内和体外实验中具有非常强烈的抗癌效果。本研究为癌症的铁死亡治疗方向提供了理论基础及药物靶点。
陈思含[2]（2021）在《血液单核细胞的β淀粉样蛋白摄取功能及其对阿尔茨海默病干预潜力的研究》文中研究指明背景和目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是最常见的神经系统退行性疾病,影响全球3500万老年人健康。Aβ级联假说被认为是AD的核心病理机制。过去研究表明,Aβ在脑内过度产生和/或清除障碍间的失衡是AD发生的主要机制,且脑内产生Aβ可通过血脑屏障（BBB）进入体循环代谢。我们及同行在前期研究中发现,约有40%-60%脑内产生的Aβ是可以进入外周并被外周系统清除。但目前,外周系统清除Aβ的具体机制尚不清楚。前期研究证明,固有免疫细胞在清除Aβ中发挥重要的作用。其中,小胶质细胞是中枢神经系统中清除脑内Aβ的主要免疫细胞。血液单核细胞作为脑内小胶质细胞的外周对应细胞,被证实在神经保护、神经炎症调控以及Aβ清除功能等方面均较脑内小胶质细胞强。有研究表明,清除或者损坏外周单核吞噬细胞会加重AD小鼠脑内Aβ斑块沉积。以此为据,单核细胞可能在AD的Aβ外周清除中发挥至关重要的作用。近年来全基因组关联分析（GWAS）发现了一系列与AD相关的免疫风险基因突变,这些风险基因突变大多与小胶质细胞和单核细胞的功能及作用相关。以上证据提示外周单核细胞是Aβ外周清除的重要执行者,单核细胞Aβ清除功能障碍很可能参与AD的发生发展。但是,单核细胞Aβ清除功能在衰老和AD中如何变化,单核细胞Aβ清除功能在Aβ外周清除中的贡献大小均不清楚,而增强血液单核细胞的Aβ清除能力是否具有AD干预作用,值得深入研究。基于以上,本研究旨在探索血液单核细胞Aβ摄取功能在衰老和AD中的变化和机制,同时研究单核细胞Aβ摄取功能在Aβ外周清除中作用。根据研究结果进一步探索增强血液单核细胞Aβ摄取功能对AD的干预作用和机制。材料与方法1.分析血液单核细胞Aβ42摄取与血液Aβ水平的相关性本部分实验招募认知功能正常研究对象25例,应用Percoll非连续性密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）,将带FITC荧光标记的Aβ42与单个核细胞进行共同孵育,并应用流式细胞技术及成像流式技术筛选并检测单核细胞亚群(即CD14+CD16-、CD14+CD16+、CD14dimCD16+亚群)的Aβ42摄取功能。同时留取研究对象血浆,通过SIMOA法检测血液的Aβ水平,并应用偏相关分析单核细胞亚群Aβ摄取功能与血液Aβ水平的相关性。2.分析血液单核细胞Aβ42摄取功能随年龄增长的改变我们于大坪医院健康体检中心纳入22-89岁的认知功能正常研究对象104例,应用Percoll非连续性密度梯度离心法提取PBMC,并应用流式细胞技术筛选并检测单核细胞亚群Aβ42摄取功能。同时应用斯皮尔曼相关分析单核细胞亚群Aβ摄取功能与年龄的相关性。此外,为探索单核细胞亚群Aβ摄取功能随年龄增长的变化轨迹,我们应用Fit spline/Lowess（cubic）spline模型将单核细胞总体、经典型和非经典型亚群的摄取功能与年龄进行曲线拟合。3.分析阿尔茨海默病患者血液单核细胞Aβ42摄取功能改变（1）分析AD患者血液单核细胞Aβ42摄取功能改变纳入AD患者（24例）及其年龄与性别匹配认知正常对照（cognitively normal control,CN,25例）,脑卒中患者（10例）及其年龄与性别匹配CN（10例）。AD患者及相应对照入组后给予神经心理学检测,包括简易智能状态检测（Minimum Mental State Examination,MMSE）,日常生活活动能力（Activities of Daily Living,ADL）、临床痴呆分级评定量表（Clinical Dementia Rating,CDR）和蒙特利尔认知评估（Montreal Cognitive Assessment,Mo CA）等。应用Percoll非连续性密度梯度离心法和流式细胞技术检测并比较AD和脑卒中患者与相应对照间单核细胞亚群Aβ42摄取功能。（2）分析AD患者单核细胞Aβ摄取相关受体及Aβ降解酶的表达水平为探索AD患者血液单核细胞Aβ摄取障碍的潜在机制,我们应用免疫磁珠技术筛选出CD14阳性的单核细胞,并采用流式细胞技术检测主要参与单核细胞介导Aβ胞内摄取的相关表面受体表达变化。同时,应用免疫印迹法检测参与Aβ胞内降解的主要溶酶体酶的表达变化。4.增强单核细胞Aβ代谢功能对AD的干预作用和机制研究（1）云芝多糖对人源单核细胞Aβ代谢功能的影响我们的前期研究结果表明AD患者介导单核细胞Aβ识别的表面受体TLR2表达降低,提示AD患者单核细胞Aβ摄取功能障碍可能与TLR2表达降低有关。故本部分实验应用新型TLR2受体激动剂云芝多糖与单核细胞共同孵育,应用免疫磁珠分离法、流式细胞技术检测云芝多糖对单核细胞对Aβ42摄取功能及该过程相关表面受体表达的影响。同时,应用荧光共聚焦、酶联免疫吸附法及免疫印迹法检测云芝多糖对单核细胞对Aβ胞内提呈和降解的影响。（2）云芝多糖对APP/PS1小鼠认知功能的影响将APP/PS1雌性转基因小鼠被随机分配至两组,分别为云芝多糖预防组和PBS对照组。从小鼠3月龄开始给予云芝多糖腹腔注射（n=8）,注射剂量PSK为2mg/只（相当于100mg/kg）,3次/周,持续6个月。性别年龄匹配的APP/PS1小鼠作为空白对照组（n=8）和性别年龄匹配同窝小鼠作为野生型对照组（n=8）,均腹腔注射等体积的生理盐水,3次/周,持续6个月。既定终点后,三组小鼠均进行Y迷宫、矿场和莫里斯水迷宫等行为学测试。（3）云芝多糖对APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的影响应用流式细胞和成像流式技术检测云芝多糖对小鼠血液单核细胞亚群比例及Aβ摄取功能的影响。对药物处理至9月龄小鼠进行取材。将小鼠大脑右半球进行固定和脱水后切片,用液氮冻存小鼠左半球用于生化分析。通过免疫组织化学染色和ELISA检测AD小鼠脑内及血液的Aβ负荷。（4）云芝多糖对APP/PS1小鼠AD相关病理的影响将小鼠大脑右半球进行固定和脱水后切片,用液氮冻存小鼠左半球用于生化分析。免疫组织化学,免疫荧光染色和ELISA方法分别应用于AD小鼠脑内神经炎症、神经元凋亡和Tau蛋白过度磷酸化等指标检测。结果1.血液单核细胞Aβ42摄取与血液Aβ水平的相关性本研究发现单核细胞三个亚群均具有Aβ42摄取功能。其中,中间型亚群CD14+CD16+的Aβ42摄取功能明显高于其它两个亚群。进一步检测单核细胞Aβ42摄取功能与血液Aβ水平相关性,发现单核细胞总体及CD14+CD16-和CD14dimCD16+亚群的Aβ42摄取功能与血液Aβ42水平呈负相关。此外,单核细胞总体及CD14+CD16-和CD14+CD16+亚群的Aβ42摄取功能与血液Aβ40呈负相关。2.血液单核细胞Aβ42摄取功能随年龄增长的改变为检测血液单核细胞Aβ42摄取功能随年龄增长的改变,我们于大坪医院健康体检中心纳入104例22-89岁的认知功能正常研究对象,且不同年龄段（20-45岁、46-65岁、>65岁）间性别比例无统计学差异。我们发现,血液单核细胞总体的Aβ42摄取功能随年龄增长而降低。其中,除CD14+CD16+亚群外,单核细胞CD14+CD16-亚群和CD14dimCD16+亚群的Aβ42摄取功能随年龄增长而下降。在应用Fit spline/Lowess（cubic）spline模型将单核细胞总体、经典型和非经典型亚群的摄取功能与年龄进行曲线拟合后发现,单核细胞总体、CD14+CD16-亚群Aβ42摄取功能在20-40岁阶段下降速度较快,40岁之后下降速度相对较缓。而CD14dimCD16+亚群Aβ42摄取功能在40-60岁阶段下降速度较快,60岁之后下降速度相对较缓。该结果提示,不同单核细胞亚群对Aβ42摄取功能随年龄增长的变化趋势并不相同,且该变化可能早于脑内Aβ病理改变。3.阿尔茨海默病患者血液单核细胞Aβ42摄取功能改变为探究单核细胞Aβ42摄取功能在AD中的改变及其特异性,我们招募24例AD患者、10例脑卒中患者以及其相应性别、年龄相匹配的认知功能正常对照者各25例和10例,并检测其单核细胞Aβ42摄取功能。AD、脑卒中患者在教育年限、APOEε4基因型、高血压、糖尿病、高血脂及相应用药史等方面与其相应对照组间无统计学差异。我们发现AD患者单核细胞总体及亚群Aβ42摄取功能较对照组均降低,脑卒中患者单核细胞Aβ摄取功能较对照组无统计学差异。为探索AD患者血液单核细胞Aβ摄取障碍的潜在机制,我们检测了介导单核细胞Aβ胞内摄取的相关表面受体,包括Toll样受体2（Toll-like receptor 2,TLR2）、抗髓细胞表达触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2）、CD36、CD33以及巨噬细胞清道夫受体1（macrophage scavenger receptor 1,MSR1）。我们发现这其中仅TLR2受体表达在AD中显着下降,而其它相关受体表达在AD和CN间无显着差异。同时,为探究AD中单核细胞摄取Aβ进入胞内后其后续的Aβ降解功能是否异常,我们还检测参与Aβ胞内降解的溶酶体酶的表达量,但均未在AD和CN间发现显着差异。4.增强单核细胞Aβ代谢功能对AD的干预作用和机制研究（1）云芝多糖对人源单核细胞Aβ代谢功能的影响我们的前期研究结果表明AD患者单核细胞TLR2表达降低,而TLR2可与CD14联结合所形成的复合物可介导单核细胞对Aβ的摄取,故AD患者单核细胞Aβ摄取功能障碍可能与TLR2表达降低有关。因此我们接下来探索了激活单核细胞TLR2是否可增强单核细胞Aβ摄取功能,以及是否可降低脑内AD病理并改善认知功能。从云芝栓菌中提取出的云芝多糖（polysaccharide krestin,PSK）可以刺激调节固有免疫途径,增强固有免疫细胞功能。而且,云芝多糖还是一种新型的Toll样受体2（Toll like receptor 2,TLR2）激动剂。因此,我们利用PSK激活单核细胞TLR2观察其对Aβ摄取的影响以及对AD的干预作用。采用流式细胞技术分析并计量单核细胞胞内FITC-Aβ42平均免疫荧光强度后发现,人单核细胞Aβ42胞内摄取随云芝多糖浓度（0-200μg/ml）升高出现先增加后降低的趋势,且100μg/ml为最佳干预浓度。进一步检测云芝多糖对单核细胞Aβ降解的影响,我们发现云芝多糖干预后单核细胞胞内Aβ42水平明显低于对照组,说明云芝多糖可促进单核细胞胞内Aβ42降解过程。通过检测介导人单核细胞Aβ摄取相关的主要表面受体发现,云芝多糖只显着升高单核细胞TLR2的表达。为进一步探究云芝多糖对单核细胞Aβ摄取功能的增强作用是否通过TLR2介导,我们在给予云芝多糖处理前加入TLR2拮抗剂,发现TLR2拮抗剂可几乎抵消云芝多糖对单核细胞Aβ摄取的增强作用。同时,通过计算EEA1+、Lamp1+和Lamp2+内Aβ+42的免疫活性区面积后发现,云芝多糖处理后单核细胞胞内溶酶体途径中有更多的Aβ42,说明云芝多糖能有效促进单核细胞胞内Aβ42的降解。（2）云芝多糖对APP/PS1小鼠认知功能的影响云芝多糖处理组的APP/SP1小鼠在Morris水迷宫中行为学表现均优于注射PBS对照组,表现为逃逸时间减少、穿越隐蔽平台的次数以及在目标象限探索时间显着增加。云芝多糖处理组APP/PS1小鼠在自发性交替实验中表现出更多的进臂总次数,在新臂探索实验中表现出更多的新臂探索次数。同时,云芝多糖处理组APP/SP1小鼠在矿场实验中探索距离也显着高于对照组。以上结果提示,云芝多糖能有效缓解AD小鼠认知功能障碍。（3）云芝多糖对APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的影响本实验发现,云芝多糖能够显着较少APP/PS1小鼠脑内的致密性Aβ斑块（刚果红染色）及总Aβ斑块（6E10免疫组化染色）的数量和面积。ELISA定量分析进一步证实,云芝多糖可显着降低APP/PS1小鼠脑组织提取物Aβ及血液Aβ42含量。以上实验结果提示云芝多糖能够减轻APP/PS1小鼠脑实质及血液Aβ42的水平。通过流式细胞技术比较不同处理组小鼠单核细胞亚群的比例和Aβ42摄取功能发现,尽管小鼠血液单核细胞Ly6Clow/neg亚群的Aβ42摄取功能显着高于Ly6Chigh亚群,PSK处理组小鼠外周血单核细胞亚群比例与对照组无差异。但与对照组相比,PSK显着提高APP/PS1小鼠外周血单核细胞Aβ42摄取功能以及TLR2的表达量。通过检测脑内Aβ产生和清除过程中的相关分子水平发现,云芝多糖并不影响APP/PS1小鼠脑内APP表达,也不影响APP剪切酶的表达和活性,对脑内Aβ降解酶的表达亦无影响,表明PSK并不是通过减少脑内Aβ产生或者促进脑内Aβ降解来降低脑内Aβ含量。因此,云芝多糖可能主要通过提高单核细胞TLR2表达促进单核细胞Aβ外周清除功能,进而降低脑内Aβ水平。此外,云芝多糖还降低APP/PS1小鼠血脑屏障晚期糖基化终末产物受体（RAGE）的表达,减少Aβ从外周进入中枢,促进脑内Aβ流向外周被单核细胞清除。（4）云芝多糖对APP/PS1小鼠AD相关病理的影响与对照组相比,云芝多糖处理组APP/PS1小鼠海马内Neu N,MAP-2阳性面积显着增高,Caspase-3阳性染色水平显着降低,星形胶质细胞和小胶质细胞活化水平亦显着降低。此外,云芝多糖处理组的促炎症细胞因子水平显着低于对照组。云芝多糖皮层p Ser231-Tau阳性面积明显低于对照组。免疫蛋白印迹检测进一步发现,与对照组相比,云芝多糖组APP/PS1小鼠脑内的tau丝氨酸396位点磷酸化水平显着降低。云芝多糖处理组和对照组在APP/PS1小鼠脑内tau（Tau5）表达上无统计学差异。讨论本研究发现认知功能正常人群血液单核细胞Aβ摄取功能与血液Aβ水平紧密相关,提示单核细胞可能在Aβ外周清除中发挥重要作用。但我们发现,单核细胞的Aβ摄取功能随着年龄增长逐渐降低到。值得注意的是,单核细胞经典型亚群和非经典型亚群的Aβ摄取功能改变分别从20和40岁开始,提示单核细胞亚群的Aβ摄取功能变化是一个持续性过程且可能早于脑内Aβ沉积。此外,我们发现单核细胞的Aβ摄取功能在AD患者中进一步降低,但在脑卒中患者与相应对照组间未见显着差异,提示单核细胞Aβ摄取功能的改变可能特异性存在于AD患者中。与单核细胞Aβ摄取随年龄增长的改变不同,AD患者不仅经典型亚群和非经典型亚群的Aβ摄取功能降低,其中间型亚群Aβ摄取也较对照组降低。本研究证明中间型亚群是单核细胞三个主要亚群中对Aβ摄取功能最强一类亚群,且该亚群在Toll样受体受到刺激后,可大量分泌抗炎因子白介素-10（IL-10）。故CD14+CD16+亚群的功能障碍不仅会影响对Aβ识别功能损害,还可能导致具有神经元和认知功能保护作用的抗炎因子IL-10的分泌减少,从而加重AD的相关病理。AD患者单核细胞Aβ摄取能力下降的潜在机制尚不明确。我们在对主要介导单核细胞识别Aβ的细胞表面受体包括TLR2、CD33、CD36、TREM2、MSRA1等进行检测后发现,仅TLR2在AD中表达是下调的。TLR2属于Ⅰ型跨膜模式识别蛋白,其作为识别Aβ的天然固有免疫受体,可与CD14结合形成受体复合物共同介导单核细胞Aβ的摄取。而删除或者抑制CD14-TLR受体复合物后,将会损害人单核细胞对Aβ的摄取功能以及AD小鼠模型的认知功能。前期研究已说明单核细胞Aβ的胞内代谢途径。简述之,Aβ经单核细胞表面受体介导摄取入胞内后,形成早期内吞体,再与溶酶体结合并最终被水解酶混合物降解。且溶酶体中的组织蛋白酶D（天冬氨酸酶）和组织蛋白酶S（半胱氨酸酶）被证实可介导胞内Aβ降解。但在本研究中,我们未发现AD患者和对照组的组织蛋白酶D和S表达量有差异,提示AD单核细胞Aβ代谢功能障碍可能主要取决于对Aβ识别功能受损。以此为据,促进单核细胞TLR2的表达或可提高单核细胞Aβ摄取能力,促进脑内Aβ的外周清除。前期研究证实,变色栓菌云芝的提取物云芝多糖（polysaccharide krestin,PSK）,因其对固有免疫途径的有效调节作用已被作为处方药广泛应用于多种癌症的治疗。本研究发现云芝多糖不仅能增强单核细胞对Aβ的代谢功能,还能有效改善APP/PS1小鼠的认知功能损害及AD相关病理。为探究云芝多糖可有效促进单核细胞对Aβ的摄取以及胞内降解的潜在机制,我们检测了主要参与单核细胞Aβ摄取的表面受体,发现云芝多糖只增强TLR2的表达。此外,在提前加入TLR2拮抗剂后,云芝多糖对单核细胞激活作用几乎被抵消,说明云芝多糖对单核细胞Aβ摄取的促进作用是由TLR2受体介导的。同时,对单核细胞Aβ与EEA1、LAMP1、LAMP2的共定位免疫反应区评估后发现,云芝多糖处理后的单核细胞在胞内溶酶体途径中存在更多的Aβ,这表明PSK可促进单核细胞对Aβ胞内提呈和降解途径。值得注意的是,在APP/PS1小鼠在脑内Aβ开始沉积前给予云芝多糖的处理可降低小鼠脑内Aβ含量。我们并未发现云芝多糖处理小鼠脑内APP及其代谢产物、Aβ产生与降解相关蛋白酶在表达量上与对照组小鼠有统计学差异,说明云芝多糖并未影响小鼠脑内Aβ产生及降解过程。我们还发现,介导Aβ由外周经血脑屏障进入中枢的受体RAGE在云芝多糖处理小鼠中表达降低,提示PSK减少了由外周系统进入脑内的Aβ含量减少,也为云芝多糖激活的单核细胞在外周Aβ清除中发挥作用提供更多空间。以上结果表明,云芝多糖的作用可能主要是通过增强外周单核细胞对Aβ的识别和代谢,从而诱导脑内可溶性Aβ流入周围并被清除。此外,我们发现云芝多糖可通过减少APP/PS1小鼠脑内神经元丢失、凋亡、树突棘萎缩以及脑内神经炎症的发生,发挥神经元保护作用的同时维持脑内内环境稳态。AD中的另一病理特征,是由Tau蛋白过度磷酸化引起的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）。本研究中,云芝多糖可抑制由Aβ诱导的不同位点的Tau蛋白磷酸化,从而降低磷酸化Tau蛋白的毒性作用。结论本研究提示血液单核细胞参与Aβ的外周清除;单核细胞Aβ摄取功能障碍可能参与AD的发生;增强血液单核细胞的Aβ清除能力具有AD防治潜力。
宋瑞其[3]（2021）在《基于IFN-γ分子佐剂的重组Cathepsin L免疫抗蜱效果分析研究》文中认为背景:蜱虫是一种仅次于蚊子的第二大媒介生物,放牧草食家畜的染蜱率可达100%,极易造成蜱传病的侵染（如梨形虫病等）,严重阻碍了区域性经济和畜牧养殖的健康发展。亚洲璃眼蜱（H.as）和小亚璃眼蜱（H.an）是广泛分布于欧亚大陆和北非的硬蜱种,具有重要的医学和兽医学意义,除了叮咬吸血造成皮肤损伤、炎症等直接致病作用外,也是牲畜重要疾病和某些人畜共患病的媒介。随着杀虫剂耐药性日益增加,通过接种疫苗控制蜱虫被视为一种可持续的替代方法,这也是学术界关注的焦点。抗蜱疫苗候选抗原——组织蛋白酶L（Cathepsin L,CPL）是一种高效的血红蛋白酶,在从宿主获得血液的消化过程中起着重要作用;干扰素-γ（IFN-γ）是一种免疫调节因子,在适应性免疫中起到重要作用。目的:为了综合防控媒介蜱虫,本文首次以IFN-γ分子作为抗蜱疫苗佐剂进行H.as CPL（Has CPL）免疫,评价抗H.as和H.an的保护效果,拟达到预防媒介蜱虫的目的。主要研究方法与结果如下:（1）亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱的生物学特性研究从新疆奇台和吐鲁番等2个流行地区分别采集了317和291只硬蜱,分别进行形态学和分子生物学鉴定,及不同发育阶段的生物学特性研究。结果显示,蜱虫种属鉴定为H.as和H.an,两者的亲缘关系（同源性>99.00%）与哈萨克斯坦、甘肃等株极为接近;形态对比发现,卵、幼蜱和若蜱间差异不明显,成蜱间呈现肛侧/下板和气门板特征差异;周期对比发现,卵期H.as出现“卵斑”（后期发育成肛门）的时间（19 d）晚于H.an（14 d）,H.as的产卵和卵孵化周期（27.5 d和31.5 d）长于H.an（12.0 d和20.5 d）,H.as饱血若蜱蜕皮和成蜱吸血时间（19.0 d和8.5 d）小于H.an（30.0 d和13.0 d）,H.as和H.an完成一个生活史平均需要131.5和112.5天。（2）亚洲璃眼蜱Has CPL基因的克隆表达及鉴定利用原核表达系统构建了Has CPL/p ET-28a重组质粒并高效表达纯化出His标签融合Has CPL重组蛋白（约18.07 k Da,0.9-1.3 mg/m L）,通过Western blot验证其能被相应阳性血清特异性识别,表现出良好的反应原性;利用真核表达系统构建了Has CPL/p EGFP-C3重组质粒,经转染至BHK-21细胞,通过IFAT验证真核细胞表达的Has CPL能与阳性血清反应产生特异荧光信号,表现出良好的免疫原性。（3）BALB/c小鼠IFN-γ基因的克隆表达及鉴定利用原核表达系统构建了BALB/c小鼠IFN-γ（Mus-IFN-γ）基因的重组质粒（Mus-IFN-γ/p ET-28a）,表达纯化出His标签融合Mus-IFN-γ重组蛋白（约18.51 k Da,0.5-0.8 mg/m L）,经Western blot分析显示其印迹与Mus-IFN-γ蛋白大小位置一致,通过生物信息学方法和IFN-γ-ELISA试剂盒检测确定为IFN-γ蛋白,为后续保护性免疫试验提供了材料。（4）重组Has CPL免疫效应及其抗亚洲璃眼蜱的效果评价将6只新西兰大白兔分成两组,第一组免疫纯化的重组Has CPL,对照组免疫PBS,经过3次免疫后,分别感染H.as成蜱和幼蜱,根据兔血清中抗体、细胞因子水平及蜱虫的饱血率、饱血重量和蜕皮率等指标分析抗蜱效果。结果显示,重组Has CPL免疫后可同时诱导机体产生体液免疫（抗体效价:102 400-409 600）和细胞免疫（细胞因子:IL-4↑、IL-10↑和IFN-γ↑）反应;免疫组产生的特异性抗Has CPL的血清与H.as蜱组织（中肠;唾液腺;卵巢）中天然CPL蛋白发生反应;免疫组雌蜱充血重量（429±21.44 mg）明显低于对照组（789.86±38.28 mg）（P<0.05）;免疫组幼蜱饱血率和蜕皮率（44.40%和39.01%）均分别显着低于对照组（70.13%和54.99%）（P<0.05）;对于抗H.as总体保护效果分析,免疫Has CPL对H.as雌蜱和幼蜱分别产生54.05%和55.09%抑制作用。（5）重组Has CPL诱导交叉保护性免疫抗小亚璃眼蜱的效果评价分别对H.as和H.an两个CPL蛋白（Has CPL,Han CPL）的同源性、B细胞表位、抗原性、疏水性、等电点和温度系数等进行预测比对,然后采用Dot blot、ELISA和免疫组化（IHC）等方法进行验证,最后根据（4）中免疫方法进行交叉保护性实验。结果显示,2个CPL蛋白结构相似、同源性较高（达90.48%）;抗Has CPL血清可与H.as和H.an部分发育阶段蜱的天然CPL蛋白交叉反应;免疫组（Has CPL）饱血成蜱数量和产卵重量显着低于对照组（PBS）,抑制率分别达到21.43%（P<0.05）和38.84%（P<0.001）,对H.an侵染的交叉抑制率达到54.76%。（6）基于IFN-γ分子佐剂免疫重组Has CPL的抗蜱效果评价将实验BALB/c小鼠分为3组,第一组使用Has CPL联合IFN-γ分子共同免疫BALB/c小鼠（CPL+IFN-γ）,其他两组小鼠单独注射Has CPL（CPL）或PBS;经皮下和腹腔等2种途径免疫后,接种H.as和H.an的幼蜱,根据饱血率、蜕皮率等参数分析抗蜱效果。结果显示,联合IFN-γ分子佐剂可显着增强特异性抗体Ig G（Ig G1>Ig G2a）（P<0.001）和细胞因子（IFN-γ和IL-4,P<0.001）的产生;经流式细胞术检测,与PBS组（27.40%;6.24%）相比,用CPL+IFN-γ免疫的雌性BALB/c小鼠脾脏中CD4+T细胞水平（35.19%）显着高于CPL组（30.87%）（P<0.05）;CPL+IFN-γ组幼蜱的饱血率和蜕皮率显着低于CPL组和PBS组,且腹腔免疫效果要优于皮下免疫;皮下免疫试验显示CPL+IFN-γ组产生的抗H.as幼蜱的效果（85.11%）明显高于CPL组（63.28%）;腹腔免疫试验显示CPL+IFN-γ组产生的抗H.as和H.an幼蜱的效果（96.20%,83.41%）明显高于CPL组（62.46%,61.33%）。结论:建立了H.as和H.an实验室纯蜱饲养技术,掌握了这2种蜱虫之间生活史不同阶段的生物学特性和形态学特征的差异:“卵斑”出现时间、肛侧/下板和气门板;克隆高效表达了亚洲璃眼蜱Has CPL和BALB/c小鼠IFN-γ蛋白;Has CPL是一种潜在的交叉抗蜱候选抗原,免疫Has CPL可同时抗H.as和H.an蜱虫;Has CPL联合IFN-γ共同免疫BALB/c小鼠不仅增强了免疫应答,且增强了抗蜱效果;Has CPL有望作为一种有效的抗蜱亚单位疫苗抗原。
李玥颖[4]（2021）在《蛋白质翻译后修饰酶的荧光分析方法研究》文中进行了进一步梳理蛋白质翻译后修饰（protein post-translational modification,PTMs）是指在m RNA被翻译成蛋白质后,对蛋白质上的一个或多个氨基酸残基进行化学修饰的过程。PTMs是提高蛋白质多样性的关键机制。蛋白质翻译后修饰酶能够调控200多种蛋白质底物的翻译后修饰,根据作用机理的不同可以分为两大类:（1）水解肽键的酶（蛋白酶）和（2）共价修饰氨基酸侧链的酶。蛋白质翻译后修饰酶能够调节蛋白质的活性、定位以及与其他生物分子间的相互作用,在功能蛋白质组学中发挥着关键作用。蛋白质翻译后修饰酶活性异常与糖尿病、神经系统疾病、心血管疾病、癌症、阿尔兹海默症等多种人类疾病密切相关。蛋白质翻译后修饰酶的传统检测方法有放射性标记法、高效液相色谱法、凝胶电泳法、酶联免疫吸附法。但这些方法都存在着放射性污染、操作复杂、仪器昂贵等不足。因此,发展简单快速、灵敏度高的蛋白质翻译后修饰酶检测方法迫在眉睫。本论文以转肽酶A（sortase A,Str A）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）、蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B）、蛋白激酶（protein kinase A,PKA）为主要模型,结合核酸扩增技术、单分子成像技术和量子点（quantum dots,QDs）、磁珠等新型纳米材料,发展了一系列高灵敏度、高选择性的荧光检测方法。本论文主要研究内容如下:一、转肽酶催化的转肽反应是一种有效的修饰目标蛋白质的方法。尽管转肽酶在蛋白质化学中有着广泛的应用,但由于其荧光内滤效应引起的自猝灭,传统的荧光检测方法不足以表征转肽酶的特性。发展了一种基于转肽酶介导的分子内荧光共振能量转移（fo?rster resonance energy transfer,FRET）的单分子检测方法,检测SrtA活性。该方法利用了两个花青素染料修饰的多肽探针作为SrtA的底物,其中一个多肽探针包含LPXTG基序和供体荧光团,而另一个多肽探针包含低聚甘氨酸亲核试剂和受体荧光团。SrtA存在的情况下,催化两种多肽探针融合,并引发分子内FRET。通过全内反射荧光（total internal reflection fluorescence,TIRF）成像,在单分子水平检测FRET信号,从而实现SrtA的灵敏检测。该方法不仅可以准确测定SrtA的动力学参数,还可以检测盐酸小檗碱在细胞外和金黄色葡萄球菌细胞中对SrtA活性的抑制作用。此外,该方法具有很好的特异性,可灵敏地测定SrtA,检测限低至7.08 pM,远低于目前报道的大多数方法。该方法为深入研究SrtA活性和发现抗感染药物提供了有效工具。二、蛋白酶的表达与各种病理现象密切相关,其准确定量对临床诊断和肿瘤治疗至关重要。利用蛋白酶特异性切割和切割酶辅助信号放大技术（nicking enzyme-assisted signal amplification,NESA）,构建了一个灵敏的蛋白酶传感器,用于多种MMPs的单分子检测。该蛋白酶传感器设计了两个DNA-肽缀合物和两个荧光基团（Cy3或Cy5）和猝灭基团（BHQ2）修饰的报告探针。两个DNA-肽缀合物分别包含特定的蛋白酶裂解位点和触发DNA。当MMPs存在时,DNA-肽缀合物中的底物肽在裂解位点被特异性切割,从而释放触发DNA。磁分离后,得到的触发DNA可与相应的报告探针杂交,引发循环NESA反应,释放大量Cy3/Cy5荧光分子,最后通过基于TIRF成像的单分子荧光方法可以定量检测MMPs。利用蛋白酶水解的高特异性、循环NESA反应的高效率和单分子检测的高灵敏度,该蛋白酶传感器可同时检测多种MMPs。该方法对MMP-2活性的检测限为3.33 pM,对MMP-7的检测限为1.71 pM,优于基于目标肽的检测方法。此外,该蛋白酶传感器可用于癌细胞中MMP-2和MMP-7的测定以及蛋白酶抑制剂的筛选,在临床诊断和药物发现方面具有很大的前景。三、酪氨酸磷酸化是各种生物活动（如基因转录、m RNA加工和分子运输）和生理过程（如增殖、分化和代谢）的主要调控机制。细胞内酪氨酸磷酸化的水平受蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases,PTPs）的共同调控,但是PTPs的调控作用一直被低估。最近的研究表明,PTP1B在胰岛素/瘦素介导的信号转导中起关键的负调控作用,其异常活性与II型糖尿病和肥胖有关。另外,其他种类的PTPs活性异常与癌症密切相关。因此,高效、灵敏地检测PTPs对临床诊断、药物发现和癌症治疗具有重要意义。传统的PTPs活性检测方法主要依赖于测定32P/33P标记的磷酸化肽/蛋白底释放的放射性磷酸盐和利用液体闪烁光谱仪定量放射性物质。然而,放射性元素会对人类健康和环境造成危害。利用去磷酸化诱导的三级核酸扩增反应,发展了一种用于检测PTP1B活性的荧光方法。该方法涉及三个步骤:（1）PTP1B催化的酪氨酸去磷酸反应诱导胰凝乳蛋白酶裂解肽-DNA缀合物;（2）肽-DNA缀合物裂解诱导的指数链置换扩增产生脱氧核酶（DNAzyme）;（3）DNAzyme循环裂解信号探针导致荧光信号被放大。利用PTP1B诱导的酪氨酸去磷酸化和胰凝乳蛋白酶介导的肽裂解的高特异性、DNAzyme诱导的三级DNA扩增的高效率和磁分离产生的低背景信号,使该方法具有特异性好、灵敏度高的优点,检测限为0.24 pM。可用于动力学分析,抑制剂筛选,以及多种癌细胞中PTP1B的准确检测。四、激酶可以催化γ-磷酸基团从腺苷-5’-三磷酸（ATP）转移到特定氨基酸侧链上,在信号转导、代谢、基因表达和细胞周期进程等各种生物过程中发挥重要作用。PKA和多核苷酸激酶（polynucleotide kinases,PNK）是两种被广泛研究的激酶。虽然激酶的检测已经取得了很大的进展,但迄今为止,关于通用激酶纳米传感器的报道还很少。我们发展了以锆离子(Zr4+)的单量子点（QD）自组装为基础的通用激酶纳米传感器用于检测PKA和PNK。该纳米传感器是通过将生物素修饰的捕获探针组装到单个量子点表面来构建的。当PKA/PNK存在时,他们可以催化Cy5-修饰的肽/DNA底物磷酸化,通过Zr4+和磷酸基团之间的相互作用可以将磷酸化底物组装到QD表面,导致QD和Cy5之间发生FRET。通过单分子检测,可以很容易地测量FRET信号。该纳米传感器对PKA的检测限低至8.82×10-4U/mL,对PNK的检测限为1.40×10-5 U/mL。此外,该纳米传感器可以测量HeLa细胞内的PKA和PNK,并可用于分析酶动力学参数和筛选PKA和PNK抑制剂,在进一步的药物发现和临床诊断方面具有很大的应用潜力。
胡玥[5]（2021）在《组织蛋白酶K与慢性应激诱导的小鼠血管内膜增生的性别关联性研究》文中研究说明目的:在慢性应激与颈动脉损伤双模型中,研究慢性应激诱导的血管新生内膜增生中组织蛋白酶K（Cathepsin K,Cat K）的作用,特别是Cat K介导的调节炎症与性别相关的作用。方法:1.选取16只雄性、32只雌性健康SPF级C57BL/6J小鼠。为排除雌激素的影响,取其中16只健康雌性小鼠进行卵巢切除（OVX,Ovariectomy）手术,并将OVX手术安排在施加慢性应激前两周。将16只雄性、16只雌性、16只OVX小鼠随机分别分为应激组和非应激组。应激14天后,全部小鼠接受颈动脉结扎手术。为研究组织蛋白酶抑制剂（E64d）在慢性应激诱导的血管内膜增生中的作用,在手术前3天随机分为对照组（盐水组）和E64d组进行给药。2.手术后分别在第4天和第14天处死小鼠,取小鼠血清、颈动脉、主动脉、大肠、脑、脾、肾脏等组织进行形态学和生化研究。3.通过制备小鼠右颈动脉冰冻切片,H&E染色后观察和统计分析小鼠右颈动脉内膜增生情况。4.通过ELISA检测小鼠血清中炎症因子NLRP3的含量。5.通过Western Blot检测小鼠大肠、脑、脾、肾以及颈动脉Cat K以及相关炎症蛋白（NLRP3,Caspase-1,IL-1β,ASC）的含量。6.通过β-Gal染色分析小鼠主动脉血管老化情况。结果:1.在术前14天的慢性应激期间,与非应激组小鼠相比较,慢性应激使应激组雄性和雌性小鼠体重和内脏脂肪均明显降低。2.H&E染色结果显示,慢性应激加速小鼠右颈动脉损伤相关新生内膜的形成。与非应激组小鼠相比较,在术后第14天,慢性应激促进内膜增厚;与雄性小鼠相比,在术后第14天,慢性应激促使雌性小鼠损伤动脉的新生内膜形成较轻,差异均具有统计学意义。3.ELISA结果显示,与非应激组小鼠相比较,在术后第4天时,慢性应激促使雄性小鼠血清中NLRP3水平明显升高,而在雌性小鼠中无明显变化。4.在术后第4天,与雄性小鼠相比,雌性小鼠大肠、脑、脾、肾组织中Cat K及相关炎症因子（NLRP3,Caspase-1,IL-1β,ASC）含量较低。5.在术后第4天,与雄性小鼠相比,雌性小鼠颈动脉中Cat K及相关炎症因子（NLRP3,Caspase-1,IL-1β,ASC）含量较低。Cat K药物干预（E64d）可明显减轻上述变化,模拟血管保护作用且差异具有统计学意义。而在雌性小鼠OVX手术后,Cat K药物干预（E64d）亦可明显减轻上述变化,且差异具有统计学意义,说明Cat K的药物干预可能可以不经过雌激素起作用。结论:我们研究结果表明,慢性应激促使Cat K分泌增加,激活Cat K-NLRP3炎症小体轴,促使促炎环境产生,加速血管内膜增生,从而进一步导致再狭窄。而在雌性小鼠中,慢性应激后Cat K的活性的增长明显低于雄性小鼠;Cat K的活性降低抑制了NLRP3小体水平,从而抑制了一系列的炎症反应,以抑制再狭窄的发生。
侯婕[6]（2021）在《宿主细胞蛋白酶在猪繁殖与呼吸综合征病毒膜融合中的作用机制研究》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus,PRRSV）引起、以猪繁殖障碍和呼吸系统疾病为主要特征的病毒性疫病,给养猪行业带来了重大的经济损失。因为缺乏有效的防控手段,PRRS依旧在世界范围内广泛流行。PRRSV是具有囊膜的单股正链RNA病毒,所以其向宿主细胞质释放基因组建立感染需完成自身囊膜与宿主靶细胞膜的融合（即膜融合,membrane fusion）这一关键步骤。膜融合是由病毒膜融合蛋白介导,低p H刺激、宿主细胞蛋白酶切割等诱导和激发的复杂过程。然而,目前国内外缺乏对PRRSV膜融合分子细节的了解。因此,深入研究PRRSV膜融合机制可以为预防和控制PRRS提供新的思路和策略。本研究以宿主细胞蛋白酶为研究对象,围绕其在PRRSV膜融合中的作用机制开展了一系列研究。本研究首先利用囊膜亲脂性染料Di D标记的PRRSV病毒粒子和亚细胞定位标志物,借助激光共聚焦显微术（laser confocal microscopy,LCM）监测到PRRSV经网格蛋白介导的内吞途径（clathrin-mediated endocytosis,CME）入侵宿主细胞后于感染早期（45 min）、在Ras相关蛋白11（Ras-related protein 11,Rab11）标记的再循环胞内体（recycling endosomes）中发生膜融合;野生型（wild type,WT）、显性失活（dominant negative,DN）、组成性激活（constitutive active,CA）Rab11的转染实验进一步表明,Rab11活性在PRRSV膜融合过程中发挥着重要作用。然后,经过特异性抑制剂、小干扰RNA（small interference RNAs,si RNAs）等筛选,证实了组织蛋白酶E（cathepsin E）在低p H条件下对PRRSV膜融合至关重要。最后,通过免疫沉淀试验（immunoprecipitation,IP）、蛋白质沉降试验（pull-down）、LCM等确定了PRRSV膜融合发生时,cathepsin E识别、结合并切割PRRSV主要囊膜糖蛋白（glycoprotein,GP）5,提示该蛋白很可能发挥病毒膜融合蛋白的功能。这一研究揭示了宿主细胞蛋白酶（cathepsin E）在PRRSV经CME入侵宿主细胞后发生膜融合时的作用机制。另一方面,本研究通过反转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR,RT-PCR）和免疫印迹法（immunoblotting,IB）分析发现,猪感染高致病性PRRSV变异毒株（highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV）后会导致肺组织中弹性蛋白酶（elastase）的表达水平显着升高;然后,通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-q PCR）、半数组织培养感染量(50%tissue culture infective dose,TCID50)和IB试验显示elastase以剂量依赖性方式促进HP-PRRSV感染宿主细胞;进一步通过结合、入侵和感染试验表明elastase参与HP-PRRSV入侵过程。当加入低p H和clathrin抑制剂阻止CME后,经与早期胞内体标志物EEA1（early endosome antigen 1）的共定位试验结果显示HP-PRRSV不再位于早期胞内体中而且其感染明显下降;然而,当加入elastase后,HP-PRRSV的感染可以恢复甚至提升到更高水平;利用Di D标记的HP-PRRSV病毒粒子和细胞膜标志物,经LCM观察到elastase可介导HP-PRRSV直接在宿主细胞膜表面发生膜融合而建立感染。最后,在病毒膜融合过程中,elastase同样识别、结合和切割HP-PRRSV GP5蛋白。这一研究揭示了宿主细胞蛋白酶（elastase）在PRRSV于宿主细胞表面发生膜融合时的作用机制。综上所述,本研究首次揭示了PRRSV膜融合的分子细节,有助于阐明PRRSV感染机制,可以应用于针对病毒膜融合蛋白制备高效特异性疫苗或针对病毒膜融合过程研发抗体类和小分子类抗病毒药物,为PRRS防控提供了新的理论依据。
万许琳[7]（2021）在《NLRP3炎症小体在纳米氧化铜颗粒诱导J774A.1巨噬细胞炎症中的作用及机制研究》文中指出纳米氧化铜颗粒（Copper oxide nanoparticles,CuO NPs）是21世纪应用最为广泛的纳米材料之一,已被广泛应用于食品工业和保健产品、农业生产、医疗等领域。在食品工业及农业中,CuO NPs常被用作纳米肥料、纳米农药、纳米杀菌剂和纳米添加剂等。由于CuO NPs在各个领域的广泛应用和研究,CuO NPs逐渐被大量生产,极大增加了消费者通过相关食品接触CuO NPs的机会。由于纳米材料具有尺寸小、表面活性高的特性,它们易于与生物体的细胞器、细胞、组织器官,甚至蛋白质这类大分子物质等相互作用。通过食物经胃肠道消化吸收等进入人体的CuO NPs会造成细胞以及组织器官的功能异化,从而给消费者的健康带来诸多不利影响。CuO NPs具有较强的细胞毒性及致炎性反应,异常的炎症反应可能导致慢性或全身性炎症疾病,因此,调节炎症反应对维持机体内环境稳定至关重要。核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor containing pyrin domain 3,NLRP3）炎症小体是细胞内的一种大分子蛋白复合体,在机体免疫调节、炎症反应、抵抗外界感染和细胞损伤中发挥重要作用。多种纳米颗粒物质可诱导NLRP3炎症小体的激活和组装,促进半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1（Cysteine aspartic acid specific protease-1,caspase-1）的活化并切割白介素1β（Interleukin-1beta,IL-1β）前体,进而释放IL-1β引起机体的炎症反应。CuO NPs的促炎潜能已被确认,但具体分子机制尚不明晰。本研究以NLRP3炎症小体为切入点,明确NLRP3炎症小体在CuO NPs诱导的J774A.1细胞炎症反应中的作用,并深入探讨其具体分子机制。第一部分:以J774A.1巨噬细胞作为研究模型,并暴露于不同浓度（0,5,10,15,20μg/m L）的CuO NPs,通过Western-blot、RT-qPCR、酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、免疫荧光等分子生物学检测手段探究CuO NPs诱导的细胞毒性及炎症反应,明确NLRP3炎症小体在CuO NPs诱导的细胞炎症中的作用。首先,通过细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit 8,CCK-8）及乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）试验发现CuO NPs可显着诱导J774A.1细胞毒性及细胞膜的损伤。随后,通过RT-qPCR以及ELISA试剂盒分别检测CuO NPs暴露后细胞中IL-1βm RNA水平和细胞上清液中IL-1β的分泌情况,发现CuO NPs可显着促进IL-1β表达上调和IL-1β分泌增加且呈浓度依赖性,明确了CuO NPs诱导J774A.1细胞炎症反应的能力。最后,使用caspase-1特异性抑制剂Z-YVAD-FMK或转染小干扰核糖核酸（small interfering ribose nucleic acid,si RNA）下调NLRP3蛋白的表达等手段,可显着抑制caspase-1 p20蛋白表达、caspase-1活性及IL-1β释放,表明NLRP3炎症小体在CuO NPs诱导的细胞炎症中起到关键作用。第二部分:旨在研究CuO NPs诱导J774A.1巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的具体分子机制。首先,通过透射电子显微镜观察J774A.1细胞吞噬CuO NPs后的细胞器定位,发现J774A.1细胞吞噬CuO NPs并将其转移至溶酶体中。进一步利用溶酶体荧光探针Lysotracker red以及组织蛋白酶B底物荧光探针Magic red探究了CuO NPs对溶酶体功能的影响,通过共聚焦显微镜观察可发现CuO NPs可诱导细胞溶酶体损伤和功能异常,进而导致组织蛋白酶B的释放。组织蛋白酶特异性抑制剂CA-074 Me可部分缓解CuO NPs诱导的caspase-1活化和IL-1β的成熟和分泌,明确了溶酶体损伤及组织蛋白酶B在CuO NPs诱导的NLRP3炎症小体激活的作用。其次,由于CuO NPs在酸性条件下具有较强的溶解性,探究了CuO NPs在细胞溶酶体的溶解情况。电感耦合等离子体发射光谱法（Inductively coupled plasma optical emission spectrometer,ICP-OES）检测CuO NPs在细胞中可释放出大量Cu2+。通过电子顺磁共振（Electron Paramagnetic Resonance,EPR）结果确定CuO NPs和Cu2+产生活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的能力大小,其中EDTA可完全消除CuO NPs产生的ROS,进一步使用ROS荧光探针DCFH-DA考察CuO NPs在细胞中诱导氧化应激的能力,结果表明CuO NPs可导致J774A.1细胞中ROS增加而导致氧化应激。铜离子螯合剂四硫钼酸盐（Tetrathiomolybdate,TTM）可抑制CuO NPs诱导细胞内氧化应激,明确了CuO NPs溶解出的Cu2+才是引起细胞氧化应激的关键。最后,使用ROS清除剂乙酰半胱胺酸（N-acetyl cysteine,NAC）抑制了CuO NPs诱导的caspase-1活化以及IL-1β的释放,说明CuO NPs在细胞中释放Cu2+并引起细胞氧化应激从而进一步介导了NLRP3炎症小体的激活。此外,通过RT-qPCR、western blot以及免疫荧光等手段检测发现,CuO NPs的暴露可诱导J774A.1细胞中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路活化以积累pro-IL-1β。
曹婷[8]（2021）在《用于水解酶活性检测的小分子荧光传感器的合成与应用》文中研究说明酶是生物体正常发育和代谢中必不可少的一类非常关键的生物催化剂（biocatalyst）,众多需要较苛刻反应条件的生化反应在酶的催化作用下只需要体内极为温和的环境即可高效率并且特异性地发生。对酶活性的检测在现代医学、生理学等学科中有着极为非凡的意义,现如今已经有诸多用于酶活性监测的方法被提出,而荧光传感器检测法由于其简单便捷、响应迅速、高灵敏性、高选择性以及可以用于即时成像等众多优点在各类检测手段中脱颖而出,已经大规模地应用于免疫分析、生化传感、医学诊断成像、食品环境检测等等的一系列科学研究领域。因此,如何设计和合成出更加简洁方便、低损耗大范围使用、检测结果准确快捷并且具有多种效果的新型酶活性荧光传感器,是当今科学研究中有着极为重要意义的一个课题!本篇论文从多种类型的水解酶活性检测这一角度出发,参考以往报道过的各种荧光传感器的设计和检测思路,设计并优化用于酶活性检测传感器实验方案,利用不同的发光团和检测机理设计并制备了每种酶相应的专一性有机小分子荧光传感器。本论文中设计的酶荧光传感器都具有优良的特异性和检测性能,且制备方法简单、传感器使用方便,可以很好地在细胞、活体中进行检测和成像操作。本文主要分为以下四个部分:一、合成了线粒体靶向丁酰胆碱酯酶（BChE）荧光化学传感器（BCh E-NBD）并首次在小鼠体内进行了影像学研究。BCh E-NBD有着长的吸收（580 nm）发射（628 nm）波长,检测中非常专一不受其它分析物（尤其是乙酰胆碱酯酶）的干扰,同时有着很低的生物毒性。BCh E-NBD在多种类型细胞的线粒体中首次实现对BCh E的检测成像实验中表现良好,更进一步的在小鼠体内对BCh E进行分布成像并证实了该酶在肝组织中的广泛存在。二、设计了首例基于活性的检测中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的比率荧光传感器DCDF。DCDF选择使用五氟丙酸酐作为识别基团,在添加NE后发射波长出现显着的光谱红移情况并且其斯托克斯位移近乎有60 nm之大。DCDF有着很强的选择性并且与待测物反应非常灵敏,而且能够不受其它酶干扰的在A549和He La细胞中进行内源性识别成像。三、设计并合成了首例长发射波长体内外特异性检测焦谷氨酸氨基肽酶-1（PGP-1）的比率荧光传感器DP-1。DP-1选择了DCD-NH2作为发光基团并以焦谷氨酸作为识别基团,其与PGP-1相互作用水解断裂酰胺键,溶液的紫外可见吸收峰由420 nm移动到520 nm,同时伴随着的是荧光光谱的最大发射峰从约564nm发生显着红移变为约616 nm。更深入的分析了在炎症诱发药品存在下Hep G2和RAW264细胞中的成像情况并研究了小鼠肿瘤模型的成像,首次表明PGP-1的表达与炎症和某些肿瘤疾病之间存在着密不可分的关联。四、设计了用于专一检测焦谷氨酸氨基肽酶-1的近红外比率型荧光传感器TP-1。该传感器有着约164 nm的斯托克斯位移和0.14 ng/m L的非常低的PGP-1的检测限,TP-1与酶发生反应后发射光谱有约80 nm的红移并且溶液颜色由黄变红。TP-1同样研究了在免疫增强剂的刺激下Hep G2和RAW264.7细胞的成像情况和对小鼠与器官的成像,结合前一工作进一步证实了PGP-1与生物体内的炎症和肝脏疾病关系紧密。此外,本工作首次揭示了PGP-1在肿瘤模型小鼠中的表达远远地超过了正常状态下的小鼠。基于酶活性的荧光传感器的探索工作依然是科学研究中的热门方向,本论文通过对这几种酶传感器的研究实验,为化学、生物、医学、临床等方向提供了新的检测手段和研究思路并为将来的进一步研究奠定了基础。
王国秀[9]（2020）在《肾足细胞内补体激活通过内皮素系统介导三氯乙烯致免疫性肾损伤机制研究》文中认为研究背景三氯乙烯（trichloroethylene,TCE）是一种卤代烃类有机溶剂,在工业上广泛用作金属清洗剂和溶脂剂等。在中国,每年至少有2万名新工人受到TCE暴露的威胁。工人可通过皮肤和呼吸系统接触三氯乙烯感染职业性三氯乙烯药疹样皮炎（occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene,ODMLT）,引起多器官的免疫性损伤。该病病情凶险,病死率较高,临床表现除皮肤损害、发热、肝脏损害和浅表淋巴结肿大外,肾脏损害也是其重要临床表现之一,肾功能衰竭是导致ODMLT患者死亡的主要原因之一,研究TCE致免疫肾损伤的分子机制对于预防和治疗ODMLT具有重要意义。ODMLT通常被认为是抗原特异性T淋巴细胞介导的Ⅳ型变态反应。然而,近年来越来越多的研究表明,仅用Ⅳ型变态反应不能完全解释ODMLT的发病机理,尤其是其引起多脏器严重损伤的机制。临床和动物实验研究发现,补体系统在TCE致敏诱导的多器官免疫性损伤中也发挥了重要的作用。补体系统主要通过经典激活途径（Classical pathway,CP）,凝集素活化途径（Lectin pathway,LP）,和旁路激活途径（alternative pathway,AP）三个途径被激活,这些途径均导致中心组分补体C3裂解成生物活性片段C3a和C3b。本课题组前期研究发现,TCE经皮致敏小鼠后其肾脏肾小球中补体C3的沉积量明显增加,提示TCE致敏后肾脏局部产生的补体被激活。那么,TCE致敏后肾脏局部补体系统的激活是否介导肾脏的免疫损伤?其作用的具体分子机制是什么?大量研究证实,补体激活与内皮素-1（endothelin-1,ET-1）信号系统相关,补体系统和内皮素系统的同时活化在许多实验模型和临床病例中都有报道。而内皮素-1是肾脏损伤的标志,不仅可以作为重要的促炎症因子,诱导TNF-α、IL-1β、ICAM-1等炎性细胞因子的分泌,导致肾脏的炎症损伤;同时,内皮素-1可以通过与主要在肾脏内皮细胞上表达的内皮素B型受体（Endothelin type B receptor,ETBR）结合,介导内皮型一氧化合成酶（Endothelial nitric oxide synthase,e NOS）系统功能受损,减少NO的合成,引起ET-1/NO动态平衡失调,导致内皮细胞功能障碍,进而加重肾脏损伤。因此我们推测,TCE致敏引起的肾脏局部补体的激活,可通过进一步活化内皮素系统介导肾脏的炎症反应和肾脏内皮细胞功能障碍,进而导致肾脏的免疫损伤。研究目的建立TCE经皮致敏小鼠模型,分别采用拮抗补体激活的Cat Li,及ETBR的特异性抑制剂BQ-788对TCE致敏小鼠进行预处理,探讨TCE致敏后肾脏局部补体的激活通过内皮素系统介导肾脏免疫性损伤的具体分子机制。本项目的研究结果将进一步丰富TCE致敏引起的免疫性肾损伤的复杂作用机理,为防治ODMLT免疫性多器官损伤提供理论依据。第一部分肾足细胞内补体激活促进内皮素分泌和炎症反应介导三氯乙烯致免疫性肾损伤研究方法建立TCE经皮致敏BALB/c小鼠模型,使用能拮抗补体激活的Cat Li进行预处理,采用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）和免疫荧光（Immunofluore-scence,IF）法检测各组小鼠肾组织中C3、C3a的表达和组织定位,分别采用检测试剂盒和苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）检测各组小鼠肾功能和肾组织病理学改变,分别采用RT-PCR、IHC、ELISA法检测小鼠肾组织中ET-1的m RNA和蛋白表达,IHC法检测各组肾组织中TNF-α,IL-1β,ICAM-1等炎症细胞因子的表达情况,并采用Western blot法检测各组小鼠肾组织中NF-κBp65和p38 MAPK炎症信号通路的蛋白表达水平,探讨TCE致敏后肾脏局部补体的激活通过促进ET-1分泌及其相关炎症因子的释放,介导肾脏免疫性损伤的分子机制。结果1.各组小鼠致敏情况空白对照组和溶剂对照组小鼠分别5只,其背部皮肤都没有水肿和红斑,致敏评分都为0,致敏率均为0.00%;TCE处理组小鼠共20只,其中有8只小鼠致敏评分≥1,12只小鼠致敏评分为0,致敏率为40.00%;TCE+Cat Li联合处理组小鼠共20只,其中7只小鼠致敏评分≥1,13只小鼠致敏评分为0,致敏率为35.00%。2.各组小鼠肾组织中补体C3、C3a的沉积IHC法检测补体C3和C3a在小鼠肾组织中的沉积情况。检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组以及TCE未致敏组、TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织中无明显C3和C3a沉积;与溶剂对照组相比,补体C3和C3a在TCE致敏小鼠肾组织的沉积量显着增加（P<0.05）,且主要在肾小球中表达。经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组小鼠肾组织中C3和C3a的沉积量较TCE致敏组明显减少（P<0.05）。这些数据表明,TCE致敏小鼠肾小球中的补体系统被激活,而Cat Li能有效抑制肾脏中补体系统的活化。3.各组小鼠肾组织中补体C3、C3a的定位免疫荧光双染色法检测肾脏中C3（C3a）和Nephrin（肾足细胞标志蛋白）的共定位。空白对照组小鼠肾小球中未见明显C3和C3a沉积;而在TCE致敏组小鼠肾小球中,Nephrin表达阳性的足细胞中可以检测到大量C3和C3a。结果表明,TCE致敏小鼠肾脏补体的激活主要定位于肾小球足细胞。4.各组小鼠的肾功能检测血清Cr和BUN是反映肾功能的检测指标。检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组肾功能无显着差异（P>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组小鼠血清Cr和BUN水平显着升高（P<0.05）;经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组小鼠血清Cr和BUN水平较溶剂对照组虽有所升高,但与TCE致敏组相比明显下降（P<0.05）。结果说明,TCE致敏后出现肾功能损伤,而Cat Li通过拮抗肾足细胞内补体的活化,改善了TCE致敏小鼠损伤的肾功能。血清Cys-C和尿微量白蛋白/肌酐（Albumin-creatinin ration,ACR）水平反映肾小球滤过功能。检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组间肾小球滤过功能无显着差异（P>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组小鼠血清Cys-C和尿ACR水平显着升高（P<0.05）;经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组血清Cys-C和尿ACR水平与TCE致敏组相比显着下降（P<0.05）。结果表明,TCE致敏后小鼠肾脏肾小球滤过功能受损,而Cat Li通过拮抗足细胞内补体的活化,改善了TCE致敏小鼠受损的肾小球滤过功能。5.各组小鼠肾脏病理学检测采用HE染色检测各组小鼠肾脏病理损伤情况。病理检查发现,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织结构清晰、正常;TCE致敏组小鼠肾组织可见明显的炎性细胞浸润、细胞肿胀,可见空泡样病变和肾小球肥大;TCE+Cat Li致敏组小鼠肾组织病理损伤程度与TCE致敏组相比明显减轻,肾小球大小甚至恢复正常。6.各组小鼠肾组织中ET-1的m RNA和蛋白表达首先采用实时定量PCR法检测各组小鼠肾组织中ET-1的m RNA水平。检测结果显示,肾组织中ET-1的m RNA水平在空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组、TCE+Cat Li未致敏组间无显着差异（P>0.05）;TCE致敏组小鼠肾组织中ET-1的m RNA水平显着升高（P<0.05）;Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组肾组织中ET-1 m RNA水平与TCE致敏组相比明显降低（P<0.05）。采用IHC、ELISA法检测各组小鼠肾组织中ET-1的蛋白水平。IHC染色显示,空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织中ET-1的蛋白沉积均较少,且无显着性差异（P>0.05）;而TCE致敏组肾组织中ET-1的蛋白沉积量明显增多（P<0.05）;经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组肾组织中ET-1的蛋白沉积量较TCE致敏组明显减少（P<0.05）。ELISA结果也显示,小鼠肾组织中ET-1含量在空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组间无显着差异（P>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组肾组织中ET-1含量显着升高（P<0.05）;经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组小鼠肾组织中ET-1含量明显降低（P<0.05）。7.各组小鼠肾组织中炎性细胞因子的表达7.1各组小鼠肾组织中TNF-α的沉积IHC检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织中TNF-α的蛋白沉积较少,且差异无统计学意义（P>0.05）;而TCE致敏组小鼠肾组织中可见TNF-α的蛋白沉积量显着增多（P<0.05）;尽管TCE+Cat Li致敏组肾组织中TNF-α的蛋白沉积量较溶剂对照组也有所增多（P<0.05）,但与TCE致敏组相比,其肾组织中TNF-α的蛋白沉积量显着减少（P<0.05）。7.2各组小鼠肾组织中IL-1β的沉积IHC染色显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织IL-1β蛋白沉积较少,且无显着差异（P>0.05）;TCE致敏组肾组织中IL-1β的蛋白沉积显着增多（P<0.05）;而经Cat Li预处理后,IL-1β在TCE+Cat Li致敏组小鼠肾组织中的蛋白沉积量较TCE致敏组明显减少（P<0.05）。7.3各组小鼠肾组织中ICAM-1的沉积IHC染色显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织中ICAM-1的蛋白沉积较少,且差异无统计学意义（P>0.05）;TCE致敏组肾组织中ICAM-1的沉积量显着增多（P<0.05）;而与TCE致敏组相比,TCE+Cat Li致敏组肾组织中ICAM-1的蛋白沉积量明显减少（P<0.05）。8.各组小鼠肾组织中NF-κBp65和p38 MAPK信号通路蛋白表达水平Western blot法检测各组小鼠肾组织中NF-κBp65和p38 MAPK信号通路蛋白的表达水平。结果显示,p38和p65的蛋白表达量在所有处理组之间均无显着差异（P>0.05）。其磷酸化蛋白P-p38和P-p65的蛋白表达在空白对照组和溶剂对照组间也无显着差异（P>0.05）;而P-p38和P-p65在TCE致敏组肾组织中表达显着升高（P<0.05）;经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组肾组织中P-p65和P-p38的蛋白表达量与TCE致敏组相比明显下降（P<0.05）。结果表明,Cat Li通过拮抗肾足细胞内补体的活化,显着下调了NF-κBp65和p38 MAPK信号的表达,NF-κBp65和p38MAPK通路参与了足细胞内补体激活介导的TCE致免疫肾损伤的过程。结论1.TCE致敏后其肾组织中补体C3和C3a表达显着升高,且主要沉积在足细胞,表明TCE致敏小鼠肾脏足细胞内的补体系统被活化;2.TCE致敏后肾足细胞内补体的激活上调了肾组织中ET-1的m RNA和蛋白表达,肾脏的ET-1系统被活化;3.上调的ET-1作为促炎因子,促进了TNF-α,IL-1β,ICAM-1等炎性细胞因子的释放,导致肾脏的炎性损伤;4.p38MAPK和NF-κBp65炎症信号通路蛋白在TCE致敏小鼠肾脏中的表达显着增多,而Cat Li预处理能明显降低其表达,表明p38 MAPK和NF-κBp65信号通路参与了足细胞补体激活介导的肾脏炎症损伤的作用过程。第二部分内皮素系统通过ETBR介导肾脏内皮细胞功能障碍加重三氯乙烯致免疫性肾损伤研究方法建立TCE经皮致敏BALB/c小鼠模型,使用ETBR的特异性抑制剂BQ-788进行预处理,分别采用检测试剂盒和苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）检测各组小鼠肾功能及肾脏组织病理学改变;采用IHC法检测各组小鼠肾组织中血管内皮细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）、细胞间黏附分子（Intercellular adhesion molecules 1,ICAM-1）的表达水平,比较各组小鼠肾脏内皮细胞功能损害情况;采用试剂盒法检测各组小鼠肾组织中一氧化氮合成酶（nitric oxide synthetase,NOS）的活力;采用RT-PCR和IHC法检测各组小鼠肾组织中内皮型一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthase,e NOS）的m RNA和蛋白表达情况;采用试剂盒法检测各组小鼠肾组织中一氧化氮（Nitric oxide,NO）水平,探讨TCE致敏后肾组织中内皮素系统通过ETBR介导肾脏的免疫性损伤的作用机制。结果1.各组小鼠经皮致敏情况空白对照组和溶剂对照组小鼠分别5只,其背部皮肤均无水肿和红斑症状,致敏评分都为0,致敏率均为0.00%;TCE处理组小鼠共18只,其中有7只小鼠致敏评分≥1,11小鼠致敏评分为0,致敏率为38.89%;TCE+BQ-788联合处理组小鼠共18只,其中6只小鼠致敏评分≥1,12只小鼠致敏评分为0,致敏率为33.33%。2.各组小鼠肾组织中ET-1的m RNA和蛋白的表达分别采用RT-PCR、ELISA法检测各组小鼠肾组织中ET-1的m RNA和蛋白表达。RT-PCR检测结果显示,肾组织中ET-1的m RNA水平在空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组间无显着差异（P>0.05）;而TCE致敏组小鼠肾组织中ET-1的m RNA水平与溶剂对照组相比显着升高（P<0.05）。ELISA检测结果显示,空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组肾组织中ET-1含量无显着性差异（P>0.05）;而TCE致敏组小鼠肾组织ET-1含量显着升高（P<0.05）。结果表明,TCE致敏小鼠肾组织中ET-1的m RNA和蛋白表达均显着升高,肾脏的内皮素系统被活化,与研究一结果一致。3.各组小鼠肾功能检测血清Cr和BUN水平是反映肾功能的检测指标,检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾功能无显着差异（P>0.05）;而TCE致敏组血清Cr和BUN水平与溶剂对照组相比显着升高（P<0.05）;经BQ-788预处理后,TCE+BQ-788致敏组小鼠血清Cr和BUN水平虽较溶剂对照组也有所升高,但与TCE致敏组相比显着下降（P<0.05）。血清Cys-C和尿微量白蛋白/肌酐（ACR）水平反映肾小球滤过功能。检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组间肾小球滤过功能无显着差异（P>0.05）;TCE致敏组小鼠血清Cys-C和尿ACR水平显着升高（P<0.05）;经BQ-788预处理后,TCE+BQ-788致敏组小鼠血清Cys-C和尿ACR水平明显降低（P<0.05）。这些结果表明,TCE致敏后小鼠肾功能和肾小球滤过功能受损,而BQ-788通过拮抗ETBR,改善了内皮素系统活化介导的TCE致小鼠肾功能和肾小球滤过功能损伤。4.各组小鼠肾脏组织病理学检测采用HE染色检测各组小鼠肾组织病理损伤情况。病理检查发现,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾脏组织结构清晰无异常,无炎性细胞浸润,病理学无明显改变;而TCE致敏组小鼠肾脏可见明显的炎性细胞浸润,肾小球肿大,肾脏细胞发生空泡样病变;TCE+BQ-788致敏组小鼠肾组织炎性细胞浸润情况明显减轻,肾小球肿大情况明显改善,细胞的空泡样病变情况明显减少,病理损伤较TCE致敏组明显减轻。5.ETBR在肾组织中的定位采用免疫荧光双标法检测TCE致敏组小鼠肾组织ETBR和CD31（内皮细胞标志蛋白）的共定位。结果显示,ETBR主要在肾脏内皮细胞上表达。6.各组小鼠肾脏内皮细胞损伤情况6.1 RT-PCR法检测各组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的m RNA表达结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的m RNA表达量均无显着差异（P>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的m RNA表达均显着升高（P<0.05）;而经BQ-788预处理后,TCE+BQ-788致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的m RNA表达水平较TCE致敏组均明显下降（P<0.05）。6.2免疫组化染色法检测各组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的沉积结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的蛋白沉积很少,且无显着差异（P>0.05）;TCE致敏组肾组织中VCAM-1、ICAM-1的蛋白沉积量显着增多（P<0.05）;而经BQ-788预处理后,VCAM-1、ICAM-1在TCE+BQ-788致敏组肾组织中的蛋白沉积量明显减少（P<0.05）。结果表明,TCE致敏小鼠肾脏内皮细胞发生功能障碍或损伤,而BQ-788通过拮抗ETBR有效改善了内皮素系统介导的肾脏内皮细胞功能障碍。7.各组小鼠肾组织中一氧化氮合酶（NOS）活力采用NOS检测试剂盒检测各组小鼠肾组织中NOS活力。结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾组织中的NOS活力无显着差异（P>0.05）;但与溶剂对照组相比,TCE致敏组小鼠肾组织中NOS活力明显降低（P<0.05）;经BQ-788预处理,TCE+BQ-788致敏组小鼠肾组织NOS活力较TCE致敏组明显升高（P<0.05）。8.各组小鼠肾组织中内皮型一氧化氮合酶（e NOS）的m RNA和蛋白表达本实验采用RT-PCR和免疫组化法检测各组小鼠肾组织中e NOS的m RNA和蛋白表达。结果显示,肾组织中e NOS的m RNA和蛋白水平在空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组间差异无统计学意义（P>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组肾组织中e NOS的m RNA和蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;虽然TCE+BQ-788致敏组肾组织中e NOS的m RNA和蛋白表达水平较溶剂对照组也有所降低（P<0.05）,但与TCE致敏组相比,其肾组织中e NOS的m RNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。9.各组小鼠肾组织中NO水平采用NO检测试剂盒检测各组小鼠肾组织中NO含量。结果显示,小鼠肾组织中NO含量在空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组、TCE+BQ-788未致敏组间无显着差异（P>0.05）;而TCE致敏组小鼠肾组织中NO含量显着降低（P<0.05）;经BQ-788预处理后,TCE+BQ-788致敏组肾组织中NO含量明显升高（P<0.05）。结论1.TCE致敏后,肾组织中ET-1含量和m RNA表达量显着升高,肾脏内皮素系统被活化;2.肾脏内皮素系统通过与内皮细胞表面ETBR结合,抑制肾组织中NOS的活力,降低e NOS的m RNA和蛋白表达,减少NO的合成和释放,造成NO/ET-1动态平衡失调,介导肾脏内皮细胞功能障碍,进而加重TCE致免疫性肾损伤。3.BQ-788通过抑制ETBR,可有效减轻内皮素系统介导的肾脏内皮细胞功能障碍,改善了TCE致敏小鼠的免疫性肾损伤。
李亚兰[10]（2020）在《旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B的表达与鉴定及其在侵入宿主肠粘膜过程中作用的研究》文中研究表明旋毛形线虫（Trichinella spiralis）是一种细胞内寄生性线虫。由旋毛虫感染引起的旋毛虫病是对经济和公共卫生危害严重的一种食源性人兽共患寄生虫病。人体旋毛虫病主要因生食或半生食含旋毛虫肌幼虫囊包的肉类。旋毛虫幼虫没有口器、刺突和板齿等器官侵入宿主,旋毛虫侵入宿主、在体内迁移的机制并不明确。研究认为旋毛虫肌幼虫侵入小肠粘膜不仅有机械力穿透作用,旋毛虫分泌的蛋白酶类对肠粘膜上皮细胞的损伤,在肌幼虫侵入小肠粘膜的过程中亦发挥着关键作用。半胱氨酸蛋白酶是一类重要的分布于多种生物体内的蛋白水解酶,不但具有蛋白水解及代谢的基本功能,还在寄生虫脱包囊/包囊形成、侵入宿主粘膜屏障、免疫逃避等过程中发挥着重要作用。本研究中,旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B（TsATG4B,Genbank:XM＿003371464）属于半胱氨酸蛋白酶CA分支,C54蛋白酶家族,是旋毛虫早期感染血清识别成虫可溶蛋白,并通过质谱分析鉴定出的一种半胱氨酸蛋白酶。本研究构建重组质粒并进行原核系统表达,通过重组TsATG4B蛋白（rTsATG4B）的免疫原性分析、酶活性分析和生物学功能特性研究,对其在旋毛虫感染中的免疫保护作用及其在旋毛虫侵入宿主肠粘膜过程中的作用等进行系列研究。期望进一步明确旋毛虫侵入宿主肠粘膜组织的机制,并为新型疫苗的发展和寻求新的旋毛虫病治疗药物靶点做基础研究工作。材料与方法1.实验动物,旋毛虫虫种保种和收集,血清、细胞培养,质粒及菌株实验动物BALB/c小鼠和昆明小鼠均购自河南省实验动物中心,旋毛虫ISS534株最初是从中国河南省南阳地区家猪中分离的旋毛虫T1株,昆明雌性小鼠保种并传代。实验血清包括感染小鼠血清、免疫小鼠血清和正常小鼠血清。原核表达载体为p QE80L,克隆菌、表达菌分别为DH5α、BL21大肠杆菌菌株。小鼠小肠上皮细胞（IECs）来自本课题组前期分离BALB/c胎鼠小肠并保存,小鼠成肌细胞（C2C12）、人类结肠癌细胞（HT29）为本实验室保存。2.TsATG4B的生物信息学分析、克隆与表达利用NCBI、Ex Pasy、Signal P4.1 server、EMBI、TMHMM Server v.2.0等网站,在线对TsATG4B蛋白理化性质、结构域、信号肽、跨膜结构域等进行生物信息学分析及预测。SWISS-MODEL在线建模并预测TsATG4B分子空间结构;利用MEGA 7.0软件采用最大简约法构建系统进化树。构建重组质粒TsATG4B-sig-p QE80L/BL21进行大肠杆菌原核表达系统表达并进一步纯化,将纯化的rTsATG4B蛋白免疫BALB/c小鼠获得免疫小鼠血清,并用ELISA法检测免疫血清滴度及其引起的免疫应答类型。3.rTsATG4B蛋白的酶活性鉴定及其与IECs细胞的作用应用稀释法复性rTsATG4B蛋白并超滤浓缩,SDS-PAGE鉴定后,明胶酶谱法检测rTsATG4B活性及特异性抑制剂E-64对rTsATG4B活性的抑制作用。Cytation 5 imaging reader（Bio Tek）检测rTsATG4B断裂底物Ac-KKCha G-AFC后,在Ex/Em=380/500 nm时荧光值变化,进行酶动力学分析,并分别检测抑制剂E-64对rTsATG4B活性的影响及最适p H值、最适温度。Far-Western blot,ELISA,IFA检测rTsATG4B与IECs蛋白的相互作用。rTsATG4B与IECs共孵育后,对照木瓜蛋白酶与PBS观察对IECs细胞单层的损伤作用;多重细胞免疫荧光检测rTsATG4B对HT29细胞形态及细胞间连接蛋白E-cadiherin、Occludin、Claudin-1的作用及改变。应用抗rTsATG4B血清通过组织免疫荧光实验分别检测感染旋毛虫2 h、6 h、8 h、12 h小鼠小肠粘膜组织的损伤及改变。通过细胞免疫荧光及流式细胞术检测rTsATG4B对IECs的凋亡作用。4.TsATG4B的表达、定位及其在旋毛虫侵入宿主肠粘膜过程中的作用Western blot分析rTsATG4B蛋白抗原性和免疫原性,应用Real time-PCR观察TsATG4B基因在旋毛虫不同发育期的转录水平;应用间接免疫荧光实验（IFT）分析TsATG4B蛋白在旋毛虫的表达及其在虫体组织的定位。应用旋毛虫体外侵入IECs实验模型,观察rTsATG4B、抗rTsATG4B血清及特异性抑制剂E-64对旋毛虫肠道感染性幼虫侵入IECs的影响。5.rTsATG4B对旋毛虫感染的免疫保护作用将4-6周龄BALB/c雌鼠60只随机分为3组（每组20只）:rTsATG4B蛋白免疫组、弗氏佐剂对照组和PBS组。rTsATG4B蛋白组,每只小鼠20μg rTsATG4B蛋白每隔2周皮下免疫1次,共免疫3次。ELISA法检测Ig G、Ig G1、Ig G2a抗体水平。末次免疫后2周,每只小鼠攻击感染旋毛虫肌幼虫300条,分别于攻虫后6 d和35 d每组各剖杀10只小鼠,收集肠道成虫和肌幼虫,计算成虫减虫率和肌幼虫减虫率,评价rTsATG4B对旋毛虫感染的免疫保护作用。6.统计学分析使用IBM SPSS Statistics 25.0（美国IBM公司）对数据进行统计分析。TsATG4B基因在ML、IIL、3 d AW、6 d AW和NBL中的相对表达数据以均数±标准差（Mean±SD）显示,采用单因素方差分析比较各组之间的差异。使用卡方检验分析不同浓度（0-15μg/m L）的rTsATG4B和不同血清稀释度时侵入IECs细胞单层百分比的差异。统计学显着性定义为P<0.05。结果1.TsATG4B的生物信息学分析,克隆、表达TsATG4B基因ORF为基因序列全长,总长1245 bp,编码414个氨基酸,其中包括1个Peptidase＿C54保守结构域;TsATG4B蛋白分子量为46.94 k Da,p I为5.79;预测为非分泌性蛋白质,无跨膜结构域;基因全长由金唯智公司合成,建重组质粒TsATG4B-sig-p QE80L/BL21进行原核表达系统诱导表达蛋白,rTsATG4B存在于包涵体沉淀。SDS-PAGE结果表明,rTsATG4B蛋白纯化理想,分子量为43 k Da,与推算TsATG4B蛋白分子量大小一致。2.rTsATG4B蛋白复性及酶活性鉴定明胶酶谱显示rTsATG4B复性后能水解明胶基质,水解作用能被半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64抑制。合成荧光肽段底物Ac-KKCha G-AFC,应用Cytation 5imaging reader（Bio Tek）进行酶动力学分析,rTsATG4B最适反应温度与最适p H值分别为37℃和p H=5.5。依据米氏方程得出rTsATG4B对Ac-KKCha G-AFC的动力学参数Vmax=2.391 n M/min,Km=60.06 n M/min。rTsATG4B在37℃,p H=5.5,能够水解羊免疫球蛋白、人免疫球蛋白、鼠尾I型胶原蛋白及小鼠血红蛋白,随rTsATG4B浓度的升高,底物被水解更彻底。3.rTsATG4B蛋白的鉴定及其在旋毛虫侵入宿主肠粘膜上皮细胞过程中的作用Real time-PCR结果表明,TsATG4B基因在旋毛虫不同发育阶段均有转录,其中6天成虫期转录水平最高（F=98.144,P<0.01）。Western blot分析发现rTsATG4B可被旋毛虫感染小鼠血清、抗rTsATG4B小鼠血清识别。rTsATG4B免疫小鼠血清可识别不同发育期旋毛虫及肌幼虫ES中TsATG4B,说明rTsATG4B具有良好的免疫原性且为分泌性蛋白。IFT结果表明,TsATG4B在虫体定位于表皮,杆状体及胚胎周围。旋毛虫肠道感染性幼虫体外侵入IECs实验结果显示:rTsATG4B对旋毛虫感染性幼虫侵入IECs单层有明显的促进作用,该促进作用与rTsATG4B具有剂量依赖关系（r=0.97,P<0.01）,随rTsATG4B剂量的增加而呈现出上升趋势（F=52.623,P<0.01）。E-64能抑制rTsATG4B促进侵入的作用。与正常血清组相比,抗rTsATG4B血清和感染血清对侵袭具有抑制作用（χ2=112.418,P<0.01）。抗rTsATG4B血清的抑制作用随着稀释度的增加呈下降趋势,并且与抗rTsATG4B血清呈剂量依赖关系（r=0.96,P<0.01）。4.rTsATG4B对IECs的特异性结合及损伤作用Far-Western blot及ELISA检测结果显示,rTsATG4B与IECs具有特异性结合作用。细胞及组织间接免疫荧光实验表明,rTsATG4B可与IECs及小鼠小肠粘膜组织特异性结合,与C2C12细胞和小鼠肝组织无特异性结合。激光共聚焦显示结合部位为IEC胞质和胞膜。rTsATG4B对IECs细胞单层具有损伤作用,其损伤作用能被E-64抑制。多重细胞免疫荧光标记HT29细胞间连接蛋白E-cadiherin、Occludin、Claudin-1结果显示,rTsATG4B损伤HT29单层细胞并破坏细胞间连接蛋白。组织免疫荧光（抗rTsATG4B血清1:100）检测感染旋毛虫2 h、6 h、8 h、12 h小鼠小肠粘膜揭示,TsATG4B蛋白参与旋毛虫侵入小鼠小肠粘膜并引起肠粘膜损伤的病理改变,TsATG4B是旋毛虫侵入宿主肠粘膜的一种重要蛋白酶。应用Annexin V-FITC抗体及ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒通过荧光显微镜及流式细胞仪检测rTsATG4B具有促发IECs凋亡损伤的作用。5.rTsATG4B对旋毛虫感染的免疫保护作用将rTsATG4B免疫4-6周龄BALB/c雌鼠3次后ELISA检测小鼠抗rTsATG4B抗体滴度为1:105,分析抗rTsATG4B血清Ig G亚型,Ig G1抗体水平显着高于Ig G2a抗体水平,表明rTsATG4B免疫小鼠后引起Ig G1升高为主型免疫反应。将300条旋毛虫幼虫攻击感染免疫小鼠后6 d与35 d,肠道6 d成虫和肌幼虫减虫率分别为53.7%和53.8%,表明rTsATG4B免疫小鼠对旋毛虫感染具有一定免疫保护作用。结论:1.rTsATG4B蛋白具有良好的免疫原性,具有半胱氨酸蛋白酶水解功能,诱导了Ig G1升高为主型免疫反应,对旋毛虫感染具有较好的免疫保护作用;2.TsATG4B可破坏细胞间连接蛋白,损伤IECs细胞单层,并诱导细胞凋亡,促进旋毛虫侵入宿主小肠粘膜上皮细胞;TsATG4B是参与旋毛虫侵入小鼠小肠粘膜组织过程中的一种重要蛋白酶。
二、组织蛋白酶B酶联免疫吸附测定方法的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、组织蛋白酶B酶联免疫吸附测定方法的建立（论文提纲范文）
（1）氧化应激感受蛋白Pirin在癌细胞铁死亡中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 细胞的动态平衡 |
| 2.2 细胞死亡类型 |
| 2.2.1 细胞坏死（Necrosis） |
| 2.2.2 细胞凋亡（Apoptosis） |
| 2.2.3 坏死性凋亡（Necroptosis） |
| 2.2.4 细胞焦亡（Pyroptosis） |
| 2.2.5 自噬（Autophagy） |
| 2.2.6 铁死亡 （Ferroptosis） |
| 2.3 细胞铁死亡概述 |
| 2.3.1 细胞铁死亡与其他类型细胞死亡的区别 |
| 2.3.2 细胞铁死亡的机制 |
| 2.3.3 细胞铁死亡中参与的调节通路 |
| 2.3.4 细胞铁死亡在癌症中的作用 |
| 2.4 Pirin—氧化应激感受蛋白 |
| 2.4.1 Pirin的蛋白质结构及生理功能 |
| 2.4.2 Pirin在癌症发生发展中的作用 |
| 第3章 实验研究 |
| 实验一 PIRIN在铁死亡中作用的研究 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 无胸腺免疫缺陷裸鼠 |
| 1.3主要试剂和仪器 |
| 1.3.1 实验材料和试剂 |
| 1.3.2 液体试剂的配制 |
| 2. 实验步骤 |
| 2.1 细胞培养、传代、接种培养板 |
| 2.2 细胞药物处理 |
| 2.3 细胞质蛋白裂解分离 |
| 2.4 蛋白浓度测定 |
| 2.5 Western blot免疫印迹分析 |
| 2.6 细胞毒性试验 |
| 2.7 实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR） |
| 2.8 shRNA转染实验 |
| 2.9 脂质过氧化物测量实验 |
| 2.10 ELISA酶联免疫吸附实验 |
| 2.11 体内原位种植瘤实验 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Erastin诱导胰腺癌细胞铁死亡中Pirin表达上调 |
| 3.2 RSL3诱导胰腺癌细胞铁死亡中Pirin表达上调 |
| 3.3 胰腺癌细胞铁死亡中抑制脂质活性氧产生可抑制Pirin表达上调 |
| 3.4 胰腺癌细胞铁死亡中脂质活性氧产生增多 |
| 3.5 胰腺癌细胞铁死亡中NFE2L2参与调节Pirin表达 |
| 3.6 胰腺癌细胞中敲除NFE2L2可抑制Pirin蛋白水平的表达 |
| 3.7 抑制Pirin表达可促进癌细胞铁死亡 |
| 3.8 抑制Pirin表达可导致癌细胞脂质活性氧增多 |
| 3.9 Pirin 限制长链酰基辅酶 A 合成酶 4（ACSL4）依赖的铁死亡 |
| 3.10 Pirin敲除抑制小鼠细胞移植瘤生长 |
| 3.11 小鼠移植瘤中Pirin敲除导致ACSL4表达上调 |
| 3.12 小鼠移植瘤中 Pirin 敲除导致丙二醛（MDA）水平增加 |
| 3.13 小鼠移植瘤中半胱氨酸蛋白酶3活性与Pirin敲除不相关 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 PIRIN在铁死亡中机制的研究 |
| 1. 材料方法 |
| 2. 实验步骤 |
| 2.1 sh RNA的细胞转染 |
| 2.2 细胞质蛋白裂解分离 |
| 2.3 蛋白浓度测定 |
| 2.4 Western blot免疫印迹分析 |
| 2.5 细胞毒性试验 |
| 2.6 实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR） |
| 2.7 ELISA酶联免疫吸附实验 |
| 2.8 体内原位种植瘤实验 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 敲除Pirin在胰腺癌细胞铁死亡中导致DNA损伤 |
| 3.2 敲除Pirin在胰腺癌细胞铁死亡中导致HMGB1细胞质移位和胞外释放 |
| 3.3 敲除Pirin促进RSL3诱导的HMGB1/BECN1结合及自噬小体的形成 |
| 3.4 Pirin通过阻止HMGB1介导的自噬抑制细胞铁死亡 |
| 3.5 小鼠移植瘤中Pirin敲除导致HMGB1释放增加 |
| 4. 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 创新性与未来研究方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）血液单核细胞的β淀粉样蛋白摄取功能及其对阿尔茨海默病干预潜力的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 血液单核细胞Aβ摄取功能与血液Aβ水平的相关性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 主要实验方法 |
| 2.3 主要实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 血液单核细胞Aβ摄取功能随年龄增长的变化 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 主要实验方法 |
| 3.3 主要实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 阿尔茨海默病患者血液单核细胞Aβ摄取功能改变 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 主要实验方法 |
| 4.3 主要实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 增强单核细胞Aβ代谢功能对AD的干预作用和机制研究 |
| 5.1 云芝多糖对人源单核细胞Aβ代谢功能的影响 |
| 5.1.1 材料与试剂 |
| 5.1.2 主要实验方法 |
| 5.1.3 主要实验结果 |
| 5.1.4 讨论 |
| 5.2 云芝多糖对APP/PS1小鼠认知功能的影响 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 主要试验方法及步骤 |
| 5.2.3 实验数据统计 |
| 5.2.4 实验结果 |
| 5.2.5 讨论 |
| 5.3 云芝多糖对APP/PS1小鼠脑内和血液Aβ水平的影响 |
| 5.3.1 材料与试剂 |
| 5.3.2 实验方法 |
| 5.3.3 实验数据统计 |
| 5.3.4 主要实验结果 |
| 5.3.5 讨论 |
| 5.4 云芝多糖对APP/PS1小鼠AD相关病理的影响 |
| 5.4.1 材料与试剂 |
| 5.4.2 实验方法 |
| 5.4.3 实验数据统计 |
| 5.4.4 实验结果 |
| 5.4.5 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Role of blood monocytes in peripheral Amyloid-βclearance in Alzheimer disease |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）基于IFN-γ分子佐剂的重组Cathepsin L免疫抗蜱效果分析研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究目的及意义 |
| 1.2 亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱的流行病学现状及其危害 |
| 1.3 抗蜱候选保护性抗原研究现状 |
| 1.4 抗蜱疫苗的保护机制 |
| 1.5 半胱氨酸蛋白酶家族 |
| 1.6 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫(包括硬蜱)体内分布和功能 |
| 1.7 半胱氨酸蛋白酶在蜱血液消化中的作用 |
| 1.8 半胱氨酸蛋白酶在蜱胚胎发育中的作用 |
| 1.9 抗蜱疫苗佐剂研究进展与临床应用 |
| 1.10 研究思路及主要内容 |
| 1.11 拟解决关键问题 |
| 1.12 技术路线 |
| 第2章 亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱生物学特性研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 亚洲璃眼蜱组织蛋白酶L(Has CPL)基因的克隆、表达及鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 BALB/c小鼠γ干扰素(Mus-IFN-γ)基因的克隆、表达及鉴定 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 重组Has CPL免疫效应及其抗亚洲璃眼蜱的效果评价 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 重组Has CPL诱导交叉保护性免疫抗小亚璃眼蜱的效果评价 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 基于IFN-γ佐剂免疫重组Has CPL的抗蜱效果评价 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）蛋白质翻译后修饰酶的荧光分析方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质翻译后修饰的概述 |
| 1.2 蛋白质翻译后修饰酶 |
| 1.2.1 蛋白质翻译后修饰酶概念 |
| 1.2.2 蛋白质翻译后修饰酶分类及功能 |
| 1.2.3 蛋白质翻译后修饰酶研究意义 |
| 1.3 蛋白质翻译后修饰酶检测方法 |
| 1.3.1 比色分析方法 |
| 1.3.2 电化学检测法 |
| 1.3.3 表面增强拉曼散射检测法 |
| 1.3.4 化学发光检测方法 |
| 1.3.5 荧光检测法 |
| 1.3.6 单分子检测法 |
| 1.4 本论文的研究内容及意义 |
| 第二章 基于分子内FRET的单分子法检测法定量转肽酶活性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和材料 |
| 2.2.2 反相高效液相色谱法测定 |
| 2.2.3 转肽酶A诱导的转肽反应和荧光光谱分析 |
| 2.2.4 单分子检测和数据分析 |
| 2.2.5 筛选抑制剂 |
| 2.2.6 动力学分析 |
| 2.2.7 金黄色葡萄球菌细胞转肽酶A活性的测定 |
| 2.2.8 纤维蛋白原结合实验 |
| 2.2.9 盐酸小檗碱存在下金黄色葡萄球菌细胞生长曲线测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 检测转肽酶活性的基本原理 |
| 2.3.2 方案的可行性验证 |
| 2.3.3 单分子检测分析 |
| 2.3.4 优化反应条件 |
| 2.3.5 灵敏度分析 |
| 2.3.6 选择性分析 |
| 2.3.7 酶动力学分析 |
| 2.3.8 抑制剂筛选 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 基于DNA-肽缀合物构建的蛋白酶传感器用于同时检测多种基质金属蛋白酶 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和材料 |
| 3.2.2 金属基质蛋白酶反应和磁分离 |
| 3.2.3 切口酶辅助信号放大反应和荧光光谱测量 |
| 3.2.4 单分子检测 |
| 3.2.5 凝胶电泳分析 |
| 3.2.6 抑制剂筛选 |
| 3.2.7 细胞培养和细胞提取物的制备 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.0 基质金属蛋白酶检测的原理 |
| 3.3.1 方案的可行性验证 |
| 3.3.2 单分子检测 |
| 3.3.3 优化反应条件 |
| 3.3.4 灵敏度分析 |
| 3.3.5 选择性分析 |
| 3.3.6 酶动力学分析 |
| 3.3.7 抑制剂筛选 |
| 3.3.8 实际样品分析 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 去磷酸化诱导的三级DNA扩增方法灵敏检测蛋白酪氨酸磷酸酶 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 底物与磁珠的连接反应 |
| 4.2.3 PTP1B诱导的酪氨酸去磷酸化反应 |
| 4.2.4 去磷酸产物诱导的DNAzyme的三级DNA扩增反应 |
| 4.2.5 凝胶电泳和荧光检测 |
| 4.2.6 抑制剂实验 |
| 4.2.7 细胞的培养和提取实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 PTP1B的检测原理 |
| 4.3.2 方案的可行性验证 |
| 4.3.3 优化反应条件 |
| 4.3.4 灵敏度分析 |
| 4.3.5 选择性分析 |
| 4.3.6 酶动力学分析 |
| 4.3.7 抑制剂筛选 |
| 4.3.8 实际样品分析 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 基于锆离子介导的单量子点自组装的通用纳米传感器检测激酶活性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 QD-捕获探针纳米结构的制备 |
| 5.2.3 QD-Zr~(4+)-Cy5 纳米结构的制备和荧光光谱分析 |
| 5.2.4 单分子检测和数据分析 |
| 5.2.5 抑制剂筛选 |
| 5.2.6 细胞培养和细胞提取物的制备 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.0 基于单个QD的纳米传感器用于PKA活性检测的原理 |
| 5.3.1 FRET测量与分析 |
| 5.3.2 单分子检测分析 |
| 5.3.3 优化反应条件 |
| 5.3.4 灵敏度分析 |
| 5.3.5 选择性分析和抑制剂筛选 |
| 5.3.6 实际样品分析 |
| 5.3.7 基于单个QD的纳米传感器用于PNK活性检测 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（5）组织蛋白酶K与慢性应激诱导的小鼠血管内膜增生的性别关联性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般情况 |
| 2.2 雄性小鼠与雌性小鼠右颈动脉H & E染色光镜观察结果 |
| 2.3 雄性小鼠与雌性小鼠血清中炎症相关因子NLRP3的浓度 |
| 2.4 雄性小鼠与雌性小鼠各组织中Cat K蛋白的表达 |
| 2.5 雄性小鼠与雌性小鼠各组织中炎症相关蛋白的表达 |
| 2.6 雄性小鼠与雌性小鼠右颈动脉中Cat K及炎症相关蛋白的表达 |
| 2.7 OVX小鼠右颈动脉H & E染色光镜观察结果 |
| 2.8 OVX小鼠与雌性小鼠右颈动脉中CatK及炎症相关蛋白的表达 |
| 2.9 雄性小鼠与雌性小鼠主动脉β-Gal染色结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 组织蛋白酶与动脉粥样硬化性心血管疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（6）宿主细胞蛋白酶在猪繁殖与呼吸综合征病毒膜融合中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.1 临床症状 |
| 1.2 病理特征 |
| 1.3 诊断方法 |
| 1.4 防控措施 |
| 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 2.1 PRRSV的基因组特性 |
| 2.2 PRRSV的非结构蛋白 |
| 2.3 PRRSV的结构蛋白 |
| 2.4 PRRSV的感染周期 |
| 第三章 囊膜病毒膜融合机制研究进展 |
| 3.1 囊膜病毒膜融合概述 |
| 3.2 囊膜病毒分类 |
| 3.3 囊膜病毒膜融合机制 |
| 3.4 研究囊膜病毒膜融合机制的科学意义和应用价值 |
| 第四章 本研究目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 组织蛋白酶E在 PRRSV膜融合过程中的作用机制研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 弹性蛋白酶在PRRSV膜融合过程中的作用机制研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）NLRP3炎症小体在纳米氧化铜颗粒诱导J774A.1巨噬细胞炎症中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 纳米颗粒概述 |
| 1.2.1 纳米颗粒的定义、分类、特性以及应用 |
| 1.2.2 CuO NPs在食品工业中的应用 |
| 1.2.3 CuO NPs进入食品的途径及暴露风险 |
| 1.2.4 CuO NPs的生物学效应 |
| 1.2.4.1 CuO NPs对细胞的影响 |
| 1.2.4.2 CuO NPs对生物体的影响 |
| 1.3 炎症小体概述 |
| 1.3.1 炎症小体的分类 |
| 1.3.2 NLRP3炎症小体的活化途径 |
| 1.3.3 纳米颗粒与NLRP3炎症小体 |
| 1.4 立题意义及主要研究内容 |
| 1.4.1 立题意义 |
| 1.4.2 研究内容及技术路线 |
| 第2章 CuO NPs激活NLRP3炎症小体诱导细胞炎症反应 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 细胞株 |
| 2.2.4 常用试剂配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 CuO NPs理化性质检测 |
| 2.3.1.1 透射电镜检测CuO NPs的直径和形貌 |
| 2.3.1.2 动态光散射检测CuO NPs的水合粒径及分散系数 |
| 2.3.2 细胞培养及处理 |
| 2.3.3 细胞活性检测 |
| 2.3.4 乳酸脱氢酶活性(LDH)检测 |
| 2.3.5 细胞总蛋白提取与定量 |
| 2.3.6 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.3.7 细胞免疫荧光 |
| 2.3.8 细胞总RNA提取与实时荧光定量PCR |
| 2.3.8.1 细胞总RNA提取 |
| 2.3.8.2 逆转录 |
| 2.3.8.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.9 si RNA转染 |
| 2.3.10 酶联免疫吸附实验 |
| 2.3.11 Caspase-1活性检测 |
| 2.3.12 统计分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 CuO NPs的物理表征 |
| 2.4.2 CuO NPs对J774A.1细胞的毒性 |
| 2.4.3 CuO NPs激活NLRP3炎症小体并促进IL-1β的表达和释放 |
| 2.4.4 CuO NPs诱导J774A.1细胞释放IL-1β依赖于caspase-1的活化 |
| 2.4.5 NLRP3炎症小体介导了CuO NPs引起的IL-1β释放 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 CuO NPs激活NLRP3炎症小体的机制分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 细胞株 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 细胞培养及处理 |
| 3.3.2 透射电镜检测CuO NPs在细胞中的定位 |
| 3.3.3 溶酶体功能检测 |
| 3.3.4 溶酶体pH检测 |
| 3.3.5 Cathepsin B活性检测 |
| 3.3.6 细胞蛋白表达 |
| 3.3.6.1 细胞总蛋白提取及定量 |
| 3.3.6.2 Western Blot |
| 3.3.7 免疫荧光 |
| 3.3.8 RNA提取与实时定量PCR |
| 3.3.9 流式细胞术检测细胞内ROS |
| 3.3.10 电子顺磁共振 |
| 3.3.11 CuO NPs离子释放 |
| 3.3.12 细胞内铜离子的测定 |
| 3.3.13 线粒体膜电位测定 |
| 3.3.14 统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 溶酶体损伤参与CuO NPs激活NLRP3炎症小体 |
| 3.4.1.1 CuO NPs在细胞溶酶体中定位 |
| 3.4.1.2 CuO NPs引起溶酶体损伤和功能紊乱 |
| 3.4.1.3 组织蛋白酶B介导了CuO NPs诱导的NLRP3炎症小体的激活 |
| 3.4.2 铜离子导致的氧化应激参与了CuO NPs激活NLRP3炎症小体 |
| 3.4.2.1 CuO NPs在细胞内释放出铜离子 |
| 3.4.2.2 铜离子是CuO NPs诱导氧化应激的主要因素 |
| 3.4.2.3 螯合铜离子或清除ROS可缓解CuO NPs诱导的NLRP3炎症小体的激活 |
| 3.4.3 Pro-IL-1β通过TLR4/MyD88/NF-κB通路进行积累 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 全文总结及展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 不足及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者攻读硕士学位期间发表科研成果 |
（8）用于水解酶活性检测的小分子荧光传感器的合成与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 荧光传感器 |
| 1.2.1 荧光及其产生机理 |
| 1.2.2 荧光传感器的构成 |
| 1.2.3 荧光传感器的检测机理 |
| 1.2.4 荧光传感器的类型 |
| 1.3 酶以及酶的分类 |
| 1.4 与疾病相关酶类的活性荧光传感器 |
| 1.4.1 水解酶类荧光传感器 |
| 1.4.2 氧化酶类荧光传感器 |
| 1.4.3 还原酶类荧光传感器 |
| 1.4.4 其他酶类荧光传感器 |
| 1.5 论文的选题意义以及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 线粒体靶向的荧光传感器用于小鼠肝脏中丁酰胆碱酯酶活性成像 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 仪器和方法 |
| 2.2.2 NBD的合成 |
| 2.2.3 探针BChE-NBD的合成 |
| 2.2.4 稳态紫外可见吸收和荧光光谱 |
| 2.2.5 检出限的计算 |
| 2.2.6 细胞毒性试验 |
| 2.2.7 细胞培养和共聚焦显微镜成像 |
| 2.2.8 斑马鱼的实时成像 |
| 2.2.9 小鼠中的荧光成像 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 BChE-NBD探针对BChE的光谱性质 |
| 2.3.2 BChE-NBD对BChE的检测限和特异性识别 |
| 2.3.3 BChE-NBD对BChE的动力学表征 |
| 2.3.4 机制的探索 |
| 2.3.5 人血清和小牛血清中BChE-NBD的光谱特性 |
| 2.3.6 HeLa和HEK293T细胞中内源性BChE的细胞成像 |
| 2.3.7 BChE-NBD在HEK293T和HeLa细胞中的共定位实验 |
| 2.3.8 斑马鱼的荧光共聚焦成像 |
| 2.3.9 小鼠荧光成像 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于活性的比率荧光小分子传感器用于内源性监测细胞内的中性粒细胞弹性蛋白酶 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 仪器和方法 |
| 3.2.2 荧光团DCD的合成 |
| 3.2.3 荧光传感器DCDF的合成 |
| 3.2.4 光物理性质的测量 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DCDF对NE的紫外-可见光吸收和荧光发射光谱特性 |
| 3.3.2 DCDF对NE的选择性检测 |
| 3.3.3 DCDF对NE的时间依赖性荧光响应 |
| 3.3.4 DCDF对NE的检测限和Michaelis-Menten曲线的动力学特征 |
| 3.3.5 DCDF对NE的pH效应 |
| 3.3.6 机制的探索 |
| 3.3.7 活细胞中NE的可视化成像 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 红光发射的比率荧光传感器对炎症模型小鼠中焦谷氨酸氨基肽酶-1 的成像 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 仪器与方法 |
| 4.2.2 检出限的计算 |
| 4.2.3 具体的选择性测试实验 |
| 4.2.4 细胞毒性测试 |
| 4.2.5 细胞培养和共聚焦显微镜成像 |
| 4.2.6 肿瘤小鼠模型中的荧光成像 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DP-1对PGP-1的光谱性质 |
| 4.3.2 机制探索 |
| 4.3.3 免疫增强剂在活细胞中上调PGP-1表达的细胞成像实验 |
| 4.3.4 肿瘤模型小鼠的成像 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 用于体内快速检测焦谷氨酸氨基肽酶-1的超灵敏近红外比率荧光免疫传感器 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 仪器与表征方法 |
| 5.2.2 传感器的合成 |
| 5.2.3 体外实验测量 |
| 5.2.4 细胞实验测量 |
| 5.2.5 小鼠实验测量 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 TP-1与PGP-1的光谱性质 |
| 5.3.2 TP-1对PGP-1的检测机制探索 |
| 5.3.3 药物诱导活细胞中PGP-1上调的共聚焦成像 |
| 5.3.4 炎症模型小鼠和肿瘤模型小鼠成像 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新性 |
| 6.3 展望 |
| 附录 |
| 附录A BChE-NBD的核磁和质谱数据 |
| 附录B DCDF的核磁和质谱数据 |
| 附录C DP-1的核磁和质谱数据 |
| 附录D TP-1的核磁和质谱数据 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）肾足细胞内补体激活通过内皮素系统介导三氯乙烯致免疫性肾损伤机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 肾足细胞内补体激活促进内皮素分泌和炎症反应介导三氯乙烯致免疫性肾损伤 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 内皮素系统通过ETBR介导肾脏内皮细胞功能障碍加重三氯乙烯致免疫性肾损伤 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 三氯乙烯致多系统免疫性损伤机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（10）旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B的表达与鉴定及其在侵入宿主肠粘膜过程中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 TsATG4B的分子生物学鉴定及其对旋毛虫感染的免疫保护作用研究 |
| 1 实验材料与试剂配制 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 旋毛虫虫种、细胞系及实验动物 |
| 1.4 质粒载体、宿主菌株 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TsATG4B生物信息学分析 |
| 2.2 TsATG4B基因克隆与表达 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 TsATG4B生物信息学分析 |
| 4.2 目的基因的合成及引物设计 |
| 4.3 TsATG4B基因的原核表达 |
| 4.4 重组质粒TsATG4B-sig-pQE80L诱导表达、可溶性分析及纯化 |
| 4.5 rTsATG4B免疫血清抗体滴度检测及抗体亚型分析 |
| 4.6 Western blot分析rTsATG4B及TsATG4B天然蛋白抗原性 |
| 4.7 rTsATG4B的复性与明胶酶谱酶活性分析及鉴定 |
| 4.8 TsATG4B在旋毛虫不同发育阶段的表达 |
| 4.9 rTsATG4B对小鼠感染旋毛虫的免疫保护作用 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分 rTsATG4B的功能分析及其在侵入宿主过程中的作用机制研究 |
| 1 实验材料与试剂配制 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 旋毛虫虫种、细胞系及实验动物 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 rTsATG4B酶活性检测 |
| 2.2 rTsATG4B降解不同蛋白质 |
| 2.3 rTsATG4B的获取,旋毛虫虫体的收集 |
| 2.4 rTsATG4B与 IEC作用的体外实验 |
| 2.5 rTsATG4B对宿主细胞的损伤作用 |
| 2.6 rTsATG4B对 IEC细胞的凋亡作用 |
| 2.7 体外侵入实验 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 rTsATG4B酶活性测定 |
| 4.2 rTsATG4B与 IEC细胞的结合 |
| 4.3 rTsATG4B对 IEC细胞的作用 |
| 4.4 rTsATG4B对 IEC细胞的凋亡作用 |
| 4.5 rTsATG4B蛋白在旋毛虫侵入过程中发挥的作用 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫中作用的研究 |
| 参考文献 |
| 个人简历、博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、组织蛋白酶B酶联免疫吸附测定方法的建立（论文参考文献）
- [1]氧化应激感受蛋白Pirin在癌细胞铁死亡中的作用及分子机制研究[D]. 胡南均. 吉林大学, 2021(01)
- [2]血液单核细胞的β淀粉样蛋白摄取功能及其对阿尔茨海默病干预潜力的研究[D]. 陈思含. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]基于IFN-γ分子佐剂的重组Cathepsin L免疫抗蜱效果分析研究[D]. 宋瑞其. 新疆农业大学, 2021(02)
- [4]蛋白质翻译后修饰酶的荧光分析方法研究[D]. 李玥颖. 山东师范大学, 2021(12)
- [5]组织蛋白酶K与慢性应激诱导的小鼠血管内膜增生的性别关联性研究[D]. 胡玥. 桂林医学院, 2021(01)
- [6]宿主细胞蛋白酶在猪繁殖与呼吸综合征病毒膜融合中的作用机制研究[D]. 侯婕. 吉林大学, 2021
- [7]NLRP3炎症小体在纳米氧化铜颗粒诱导J774A.1巨噬细胞炎症中的作用及机制研究[D]. 万许琳. 西南大学, 2021(01)
- [8]用于水解酶活性检测的小分子荧光传感器的合成与应用[D]. 曹婷. 兰州大学, 2021(09)
- [9]肾足细胞内补体激活通过内皮素系统介导三氯乙烯致免疫性肾损伤机制研究[D]. 王国秀. 安徽医科大学, 2020
- [10]旋毛虫半胱氨酸蛋白酶ATG4B的表达与鉴定及其在侵入宿主肠粘膜过程中作用的研究[D]. 李亚兰. 郑州大学, 2020(02)